Development and characterization of efficient xylose utilization strains of Zymomonas mobilis
- 作者
- Jiyun Lou, Jingwen Wang, Yongfu Yang, Qing Yang, Runxia Li, Mimi Hu, Qiaoning He, Jun Du, Xia Wang, Mian Li, Shihui Yang
- 单位
- State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, Environmental Microbial Technology Center of Hubei Province, and School of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China; China Biotech Fermentation Industry Association, Beijing 100833, China; Zhejiang Huakang Pharmaceutical Co., Ltd, Kaihua County, Zhejiang, China
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2021）
- DOI
- 10.1186/s13068-021-02082-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型Zymomonas mobilis无法利用木糖，重组菌株木糖利用效率低，无法高效发酵木质纤维素水解液中的木糖。
研究策略
结合代谢工程与适应性实验室进化：在Z. mobilis 8b中额外表达不同来源的木糖异构酶和木酮糖激酶，以木糖为选择压力进行连续传代进化，并通过基因组重测序和RNA-Seq解析分子机制。
核心内容
针对运动发酵单胞菌木糖利用效率低的瓶颈，该研究在菌株8b中比较了三种来源的木糖异构酶，确认共表达木酮糖激酶（xylB）后，表达RsXI的菌株8b-RsXI-xylB生长最佳，OD600达1.00，为对照的1.40倍。随后以木糖为选择压力进行38次连续传代（约100天）的适应性实验室进化，获得高效菌株8b-S38。该菌株在50 g/L木糖中42小时完全消耗糖，乙醇产量23.70 g/L，为亲本8b的1.52倍；在100 g/L木糖中72小时消耗全部木糖，乙醇产量达47.78 g/L；在150 g/L高糖胁迫下仍可消耗86%木糖，乙醇产量63.97 g/L，较8b提升16%至40%。在20 g/L葡萄糖与100 g/L木糖的混合糖发酵中，8b-S38几乎利用全部木糖，最大乙醇产量59.92 g/L，生产速率0.98 g/L/h。基因组重测序鉴定出三个SNP，转录组分析显示多种应激响应基因上调。结果表明强化木糖异构酶途径并结合适应性进化能显著提升木糖利用与乙醇发酵性能，8b-S38具备应用于木质纤维素生物燃料生产的潜力。
创新点
评估了三种木糖异构酶（PiXI、RsXI、RuXI）在Z. mobilis中的效果；发现增加木糖异构酶和木酮糖激酶表达可提高木糖利用；通过ALE获得高效菌株8b-S38，并系统解析了其基因组和转录组变化。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zymomonas mobilis ZM4 | 戊糖磷酸途径/木糖代谢 | talB, tktA, PiXI, xylB | 转醛醇酶, 转酮醇酶, 木糖异构酶, 木酮糖激酶 | 催化 | 在ZM4中引入完整PPP及木糖异构酶途径，验证不同XI效果 |
| Zymomonas mobilis 8b | 木糖异构酶途径 | RsXI, xylB | 木糖异构酶, 木酮糖激酶 | 催化 | 重组菌8b-RsXI-xylB，木糖利用能力最佳 |
| Zymomonas mobilis 8b | 木糖代谢 | xylA, xylB, talB, tktA | 木糖异构酶, 木酮糖激酶, 转醛醇酶, 转酮醇酶 | 催化 | 8b基因组整合表达E. coli的xylAB和talB-tktA |
| Zymomonas mobilis 8b-S38 | 木糖代谢 | ZMO0976 (xyrA) | 木糖还原酶 | 催化 | 在木糖条件下显著下调，减少木糖醇积累 |
| Zymomonas mobilis 8b-S38 | 中心碳代谢 | ZMO0578 | 钠离子二羧酸转运蛋白 | 转运 | 非同义突变，可能影响二羧酸摄取并影响生长 |
| Zymomonas mobilis 8b-S38 | 应激响应 | hrcA (ZMO0015) | 热休克基因抑制子HrcA | 调控 | 在木糖培养基中上调，调节热休克基因表达 |
| Zymomonas mobilis 8b-S38 | 应激响应/膜保护 | pspA, pspB, pspC, pspD | 噬菌体休克蛋白 | 能量供给 | 上调以维持质子动势和膜完整性 |
关键发现
- 构建的重组菌8b-RsXI-xylB生长最佳，OD600达1.00，为对照8b-EGFP的1.40倍。经38次传代（约100天）的ALE后，菌株8b-S38在50 g/L木糖中42小时完全消耗木糖（8b仅利用68%），乙醇产量23.70 g/L，为8b的1.52倍
- 在100 g/L木糖中72小时消耗全部木糖，乙醇47.78 g/L
- 在150 g/L木糖中消耗86%木糖，乙醇63.97 g/L。与8b相比，8b-S38在50-150 g/L木糖下的木糖消耗速率更快，乙醇产量提高16%~40%。混合糖（20 g/L葡萄糖+100 g/L木糖）发酵中，8b-S38几乎消耗全部木糖，最大乙醇产量59.92 g/L，最大生产速率0.98 g/L/h，为8b和8b-S8的1.38倍和1.20倍。基因组重测序发现8b-S38相对8b有3个SNP（ZMO0578、ZMO0661、ZMO0975）。RNA-Seq显示多种应激响应基因上调。
研究结论
增加木糖异构酶和木酮糖激酶基因表达并结合适应性实验室进化可显著提高Z. mobilis的木糖利用能力；8b-S38在高浓度木糖及混合糖中均可高效产乙醇，是木质纤维素生物燃料生产的优良候选菌株。