Screening novel genes by a comprehensive strategy to construct multiple stress-tolerant industrial Saccharomyces cerevisiae with prominent bioethanol production
- 作者
- Li Wang, Bo Li, Ran-Ran Su, Shi-Peng Wang, Zi-Yuan Xia, Cai-Yun Xie, Yue-Qin Tang
- 单位
- College of Architecture and Environment, Sichuan University; Institute of New Energy and Low-Carbon Technology, Sichuan University; Engineering Research Center of Alternative Energy Materials & Devices, Ministry of Education; Sichuan Environmental Protection Key Laboratory of Organic Wastes Valorization
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2022）
- DOI
- 10.1186/s13068-022-02109-x
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
工业酿酒酵母在利用不同原料进行燃料乙醇生产时面临高温、高乙醇、高糖、高盐等多重环境胁迫，缺乏清晰的遗传改造靶点，难以通过基因工程高效构建多重胁迫耐受且乙醇产量高的工业菌株。
研究策略
对多重胁迫耐受菌株E-158及其原始菌株KF-7在五种胁迫条件下的转录组进行比较分析，通过GO/KEGG富集、蛋白互作网络和转录因子调控网络分析，从28个共享差异表达基因中筛选出6个关键基因；利用CRISPR/Cas9技术对这些基因进行过表达或敲除，验证其对多重胁迫耐受性和乙醇发酵性能的影响。
研究路线图
核心内容
本研究针对工业酿酒酵母在燃料乙醇生产中面临的高温、高乙醇、高糖和高盐等多重胁迫缺乏明确遗传改造靶点的问题，以多重胁迫耐受菌株E-158及其亲本KF-7为材料，在五种胁迫条件下开展比较转录组分析，结合GO/KEGG富集、蛋白互作及转录因子调控网络，从28个共有差异表达基因中鉴定出6个关键基因（ASP3、ENA5、YOL162W、YOR012W、CRZ1、TOS8），并利用CRISPR/Cas9对其进行过表达或敲除验证。结果显示，过表达ENA5效果最为突出，使KF-7在8%初始乙醇下乙醇浓度达23.96 g/L，较对照提高27.57%；在1.5 mol/L NaCl下达52.48 g/L，提高121.42%；敲除ASP3使KF-7在44℃下乙醇浓度达44.37 g/L，提高41.35%。进一步在预处理稻草、糖蜜和木薯同步糖化发酵中，E-158-ENA5的乙醇浓度分别达68.40、98.28和138.43 g/L，均显著优于原始菌株。该研究首次揭示了ENA5等基因的多重胁迫调控功能，建立的从转录组到逆向代谢工程的筛选策略为构建适应多种原料的高效工业菌株提供了可行路径。
创新点
首次鉴定出6个与酿酒酵母多重胁迫耐受相关的新基因（ASP3、ENA5、YOL162W、YOR012W、CRZ1、TOS8）；首次揭示ENA5过表达能同时显著提高高乙醇、高温、高糖和高盐胁迫耐受性及乙醇产量；建立了从比较转录组到关键基因逆向代谢工程的高效菌株改造策略。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (KF-7, E-158) | 多重胁迫响应/氮代谢 | ASP3 | L-天冬酰胺酶II (asparaginase II) | 催化 | 敲除ASP3显著提高高温和乙醇胁迫耐受性，44℃下乙醇浓度提高41.35%，43℃+2.6%乙醇下提高99.31% |
| Saccharomyces cerevisiae (KF-7, E-158) | 离子转运/钙信号 | ENA5 | P型ATPase | 转运 | 过表达ENA5同时提高高乙醇、高温、高糖和高盐耐受性，1.5 mol/L NaCl下乙醇浓度提高101.67%~121.42% |
| Saccharomyces cerevisiae (KF-7) | 未知 | YOL162W | 未知功能蛋白 | — | 功能未知；敲除后高盐耐受性显著提高，但高温耐受性显著降低 |
| Saccharomyces cerevisiae (KF-7) | 未知 | YOR012W | 未知功能蛋白 | — | 功能未知；敲除后对多重胁迫耐受性影响较小 |
| Saccharomyces cerevisiae (KF-7, E-158) | 钙信号通路 | CRZ1 | Crz1p (锌指转录因子) | 调控 | 过表达CRZ1提高高温、高糖和渗透压耐受性，1.5 mol/L NaCl下乙醇浓度提高89.56% |
| Saccharomyces cerevisiae (KF-7) | 细胞壁组织/阳离子转运 | TOS8 | Tos8p (转录因子) | 调控 | 敲除TOS8提高渗透压和高温耐受性，1.25 mol/L NaCl下乙醇浓度提高25.13% |
关键发现
- 共筛选出28个五种胁迫条件下共有的差异表达基因
- 过表达ENA5使KF-7在8%初始乙醇下乙醇浓度达23.96 g/L，较KF-7提高27.57%
- 在1.5 mol/L NaCl下KF-7-ENA5乙醇浓度达52.48 g/L，较KF-7提高121.42%，E-158-ENA5乙醇浓度达56.73 g/L，较E-158提高101.67%
- 敲除ASP3使KF-7在44℃下乙醇浓度达44.37 g/L，较KF-7提高41.35%，在43℃+2.6%乙醇下乙醇浓度达25.91 g/L，较KF-7提高99.31%
- 过表达CRZ1在1.5 mol/L NaCl下乙醇浓度达44.93 g/L，较KF-7提高89.56%
- E-158-ENA5在预处理稻草SSF中乙醇浓度达68.40 g/L，较KF-7提高22.38%，糖蜜发酵中最高达98.28 g/L，较KF-7提高27.31%，木薯SSF中达138.43 g/L，较KF-7提高14.08%。
研究结论
ASP3、ENA5、YOL162W、YOR012W、CRZ1和TOS8六个基因可作为提高酿酒酵母多重胁迫耐受性和乙醇产量的遗传靶点，其中ENA5作用最显著。通过过表达ENA5可同时增强菌株对高乙醇、高温、高糖和高盐的耐受性，在多种工业原料发酵中均获得较高的乙醇产量，为构建适用于不同原料的高效工业酿酒酵母菌株提供了新思路。