Protein-based biorefining driven by nitrogen-responsive transcriptional machinery
- 作者
- Lianjie Ma, Liwei Guo, Yunpeng Yang, Kai Guo, Yajun Yan, Xiaoyan Ma, Yi-Xin Huo
- 单位
- Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotechnology, School of Life Science, Beijing Institute of Technology; Biology Institute, Shandong Province Key Laboratory for Biosensors, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences); School of Chemical, Materials and Biomedical Engineering, College of Engineering, University of Georgia
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2020）
- DOI
- 10.1186/s13068-020-1667-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
σ70依赖启动子驱动的蛋白转化合成高级醇的产量在细胞进入稳定期或遭遇胁迫时急剧下降，导致蛋白基生物炼制效率低下，需要实现生长阶段非依赖和抗胁迫的稳定生产。
研究策略
利用σ54介导的氮响应转录机器驱动蛋白到燃料的转化途径，通过敲除氨同化途径（gdhA、glnA等）维持氮饥饿状态以激活σ54启动子，筛选强σ54依赖启动子（argTp、glnAp2），并在最优及胁迫条件下与σ70启动子对比评价生物燃料产量。
核心内容
针对传统σ70启动子驱动的蛋白生物炼制在稳定期和胁迫条件下产量骤降的问题，该研究将σ54介导的氮响应转录机器引入大肠杆菌，用于驱动蛋白向高级醇（主要为异丁醇）的转化。通过敲除氨同化关键基因gdhA和glnA人为维持胞内氮饥饿状态，持续激活σ54依赖性启动子，并筛选出argTp和glnAp2两个强启动子。结果显示，敲除gdhA和glnA后glnAp2荧光强度从近零升至2800，再敲除lsrA后进一步增强1.8倍。在稳定期，argTp驱动下的净燃料产量达0.84 g/L，为最优σ70启动子的1.7倍，总生物燃料为2.50 g/L，较对照高16%；在400 mM NaCl渗透胁迫下产量仍达1.61 g/L，比σ70启动子高26%。补料分批发酵中，σ54系统以47.81–49.81 mg/L/h的速率持续生产168 h，终产4.05–4.78 g/L，而σ70启动子在稳定期速率下降66%–77%，72 h即停止。利用废蛋白生物质（大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、大豆粕）时，argTp平均产量达1.41 g/L，最高为σ70启动子的2.53倍。该工作证明了氮响应转录机器能实现生长阶段非依赖且抗胁迫的稳定生产，为废蛋白资源化利用提供了新思路。
创新点
首次将σ54依赖的氮响应转录机器用于蛋白基生物炼制，实现生长阶段非依赖和抗胁迫的燃料生产；通过破坏GDH和GS途径人工制造细胞内氮饥饿状态，持续激活σ54转录；发现argTp和glnAp2等σ54启动子优于常规σ70启动子，尤其在稳定期和胁迫条件下。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 氨同化途径 | gdhA | 谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 敲除以阻断GDH途径，维持氮饥饿状态 |
| Escherichia coli | 氨同化途径 | glnA | 谷氨酰胺合成酶 | 催化 | 敲除以阻断GS途径，防止NH3再同化 |
| Escherichia coli | 氨同化途径 | gltB | 谷氨酸合酶大亚基 | 催化 | 敲除gltB或gltD阻断GOGAT途径 |
| Escherichia coli | 群体感应 | lsrA | AI-2转运蛋白ATP结合组分 | 转运 | 敲除以阻断AI-2摄取，增强σ54转录活性 |
| Escherichia coli | 氮调控 | ntrB | 氮调节蛋白B | 调控 | 磷酸化NtrC激活σ54依赖转录 |
| Escherichia coli | 氮调控 | ntrC | 氮调节蛋白C | 调控 | 磷酸化后与σ54全酶作用启动转录 |
| Escherichia coli | σ54依赖启动子 | argTp | — | 调控 | σ54依赖启动子，驱动最高荧光和燃料产量 |
| Escherichia coli | σ54依赖启动子 | glnAp2 | — | 调控 | σ54依赖启动子，用于驱动途径表达 |
| Escherichia coli | 异丁醇合成途径 | alsS | 乙酰乳酸合酶 | 催化 | 将丙酮酸转化为KIV和KMV |
| Escherichia coli | 异丁醇合成途径 | ilvC | 酮醇酸还原异构酶 | 催化 | 催化KIV/KMV的还原异构 |
| Escherichia coli | 异丁醇合成途径 | ilvD | 二羟酸脱水酶 | 催化 | 将二羟酸转化为酮酸 |
| Escherichia coli | 异丁醇合成途径 | kivd | 2-酮异戊酸脱羧酶 | 催化 | 催化酮酸脱羧生成醛 |
| Escherichia coli | 异丁醇合成途径 | yqhD | 醇脱氢酶 | 催化 | 将醛还原为高级醇 |
| Escherichia coli | 氨基酸转氨途径 | leuDH | 亮氨酸脱氢酶 | 催化 | 驱动亮氨酸等释放碳骨架 |
| Escherichia coli | 氨基酸转氨途径 | avtA | 缬氨酸-丙酮酸转氨酶 | 催化 | 驱动氨基酸向酮酸转化 |
关键发现
- 敲除gdhA和glnA后，σ54启动子glnAp2的荧光强度从近0升至2800
- 进一步敲除lsrA后荧光强度再增1.8倍
- argTp荧光强度为glnAp2的1.7倍，稳定期时argTp和glnAp2荧光分别比指数期提高1.8和1.3倍
- 以argTp驱动时，稳定期净产燃料0.84 g/L，为最优σ70启动子P_LlacO1的1.7倍
- 总生物燃料达2.50 g/L，比P_LlacO1高16%
- 在400 mM NaCl渗透胁迫下argTp产1.61 g/L，比P_LlacO1高26%
- pH 5.0酸胁迫下argTp产1.77 g/L
- 补料分批发酵中σ54启动子以47.81-49.81 mg/L/h速率生产，稳定期以10.47-14.22 mg/L/h持续生产168 h，终产4.05-4.78 g/L，而σ70启动子稳定期速率下降66-77%，72 h后停止，终产仅为σ54的75-88%
- 使用废蛋白生物质（大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、大豆粕）时argTp平均产量1.41 g/L，最高为σ70启动子的2.53倍。
研究结论
氮响应转录机器（σ54系统）相比传统σ70系统能增强生物合成途径的稳健性和生产力，实现生长阶段非依赖和抗胁迫的蛋白到燃料转化，为废蛋白生物炼制提供了新策略。