Kinetic characterization of annotated glycolytic enzymes present in cellulose-fermenting Clostridium thermocellum suggests different metabolic roles
- 作者
- Steve R. Daley, Patricia Mae Gallanosa, Richard Sparling
- 单位
- Department of Microbiology, University of Manitoba, 213 Buller Building, Winnipeg, MB R3T 2N2, Canada
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2023）
- DOI
- 10.1186/s13068-023-02362-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析纤维素发酵菌Clostridium thermocellum中注释的糖酵解酶的真实催化特性与代谢角色，尤其是磷酸果糖激酶同工酶对底物和磷酸供体的选择性及其调控机制。
研究策略
将C. thermocellum中注释的PFK基因（Cthe_0347, Cthe_1261, Cthe_0389）和醛缩酶基因（Cthe_0349）在E. coli中异源表达并纯化，通过酶动力学分析、底物特异性测试、效应物抑制/激活实验以及序列比对和系统发育分析，确定各酶的真实底物、磷酸供体偏好和代谢功能。
核心内容
本研究对纤维素发酵菌Clostridium thermocellum中注释的四个糖酵解酶进行了系统的酶动力学表征。通过在大肠杆菌中异源表达并纯化磷酸果糖激酶同工酶（Cthe_0347、Cthe_1261、Cthe_0389）和醛缩酶（Cthe_0349），结合底物特异性测试、效应物调控实验及系统发育分析，重新定义了各酶的真实催化功能。结果表明，Cthe_0347（Pfp）不仅以焦磷酸为供体磷酸化果糖-6-磷酸，还能磷酸化景天庚酮糖-7-磷酸，且对后者的活性约为前者的1/16，提示其同时参与糖酵解与磷酸戊糖途径。Cthe_1261（PfkA）偏好GTP而非ATP作为磷酸供体（Km分别为0.2 mM和2.5 mM），并受磷酸烯醇式丙酮酸和焦磷酸的强烈抑制，0.05 mM焦磷酸可使活性降至约21–25%。Cthe_0389被重新鉴定为果糖激酶而非磷酸果糖激酶，AMP和ADP可将其活性降至38%。Cthe_0349则为Zn²⁺依赖的II类果糖-1,6-二磷酸醛缩酶。这些发现揭示了该菌非典型糖酵解网络的酶学基础，表明代谢物水平的变化（如焦磷酸、铵离子、磷酸烯醇式丙酮酸）对糖酵解通量具有重要调控作用，为理性改造该菌株的纤维素发酵性能提供了酶学依据。
创新点
首次证明Pfp不仅能磷酸化果糖-6-磷酸，还能磷酸化景天庚酮糖-7-磷酸；发现PfkA偏好GTP作为磷酸供体并需要铵离子激活；揭示PfkB实为果糖激酶而非磷酸果糖激酶；验证了Cthe_0349为Zn²⁺依赖的II类果糖-1,6-二磷酸醛缩酶。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 糖酵解/磷酸戊糖途径 | Cthe_0347 | Pfp (pyrophosphate-dependent phosphofructokinase) | 催化 | 以PPi为磷酸供体，能磷酸化F6P和S7P；F6P的Vmax和Km分别为39.7 μmol/mg/min（PPi）和0.075 mM（Pi）；S7P的Km为3.236 mM |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 糖酵解 | Cthe_1261 | PfkA (ATP/GTP-dependent phosphofructokinase) | 催化 | 偏好GTP（Km 0.2 mM），ATP的Km为2.5 mM；需要NH₄⁺激活，F6P呈正协同性（Hill系数3）；被PEP和PPi抑制 |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 糖酵解（果糖代谢） | Cthe_0389 | PfkB (fructokinase) | 催化 | 以果糖为底物而非F6P；可利用ATP或GTP，GTP的Km为0.2 mM；AMP和ADP抑制活性（GTP时降至38%） |
| Clostridium thermocellum ATCC 27405 | 糖酵解 | Cthe_0349 | Aldoa (fructose-1,6-bisphosphate aldolase) | 催化 | II类醛缩酶，依赖Zn²⁺；FBP的Km为0.145 mM，Vmax为27.7 μmol/mg/min |
关键发现
- Pfp以PPi为供体时，F6P的Vmax为39.7 μmol/mg/min（文献值），S7P的Vmax为6.294 μmol/mg/min，Km为3.236 mM
- 以Pi为供体时F6P的Vmax为100.222 μmol/mg/min，Km为0.075 mM，故F6P的Vmax约为S7P的16倍，Km约为S7P的1/43。PfkA对GTP的Km为0.2 mM，对ATP的Km为2.5 mM（相差12.5倍）
- 以GTP为供体时F6P的K0.5为1.9 mM（Hill系数3），Vmax为563.9 μmol/mg/min
- 以ATP为供体时F6P的Km为0.6 mM，Vmax为169.1 μmol/mg/min。PfkA被PEP和PPi抑制，0.05 mM PPi使活性降至GTP时的21%和ATP时的25%。PfkB以果糖为底物，对GTP的Km为0.2 mM，对ATP的Km为0.4 mM
- 果糖的Km在ATP时1.8 mM，GTP时0.7 mM
- Vmax均超过100 μmol/mg/min
- AMP和ADP可使其活性降至38%（GTP时）。醛缩酶Aldoa对FBP的Km为0.145 mM，Vmax为27.7 μmol/mg/min，且需要Zn²⁺。
研究结论
C. thermocellum的Pfp在糖酵解和磷酸戊糖途径中均有作用，PfkA和PfkB则可能在非纤维二糖充足生长的条件下参与其他糖代谢，共同构成其非典型糖酵解网络；这些酶的别构调控（如PPi、NH₄⁺、PEP）支持代谢物对糖酵解的调控作用。