A highly efficient transcriptome-based biosynthesis of non-ethanol chemicals in Crabtree negative Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Zhen Yao, Yufeng Guo, Huan Wang, Yun Chen, Qinhong Wang, Jens Nielsen, Zongjie Dai
- 单位
- Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences; National Center of Technology Innovation for Synthetic Biology; Laboratory of Evolutionary and Functional Genomics, School of Life Sciences, Chongqing University; Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology; Beijing Advanced Innovation Center for Soft Matter Science and Engineering, Beijing University of Chemical Technology
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2023）
- DOI
- 10.1186/s13068-023-02276-5
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学/发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母的Crabtree效应导致在有氧和过量葡萄糖条件下大量产生乙醇，造成非乙醇化学品生物合成中碳流失，需构建并验证Crabtree阴性底盘菌株的生物合成潜力。
研究策略
利用已构建的快速生长Crabtree阴性酿酒酵母sZJD-28，通过转录组比较分析其与Crabtree阳性菌株CEN.PK113-11C的代谢差异；再基于转录组结果，在丙酮酸、丙二酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A和莽草酸四个代表性代谢节点分别构建产物合成途径，比较两菌株生产非乙醇化学品的能力。
核心内容
本研究以快速生长的Crabtree阴性酿酒酵母sZJD-28为底盘，通过转录组测序比较其与Crabtree阳性菌株CEN.PK113-11C的代谢差异，并在丙酮酸、丙二酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A和莽草酸四个代表性节点分别构建产物合成途径，系统评估两菌株生产非乙醇化学品的潜力。转录组分析显示sZJD-28中翻译相关基因下调而碳代谢基因显著上调，碳流更多导向目标产物而非乙醇。在2,3-丁二醇、乳酸、对香豆酸、法呢烯、番茄红素、3-羟基丙酸和游离脂肪酸七种产物的生产中，sZJD-28均表现出明显优势：2,3-丁二醇空质粒菌株产量达208.4 mg/L，较对照提高13倍以上；乳酸产量达3.18 g/L，比产量提高64.9%；番茄红素产量34.4 mg/L，提高1.88倍；游离脂肪酸在敲除PAH1并经补料分批发酵后产量达6295.6 mg/L，比产量247.7 mg/L/OD，为酿酒酵母中报道的最高值。结果表明sZJD-28因碳源和能量流向代谢物合成重定向，可作为一种有前景的非乙醇化学品合成生物学底盘细胞。
创新点
首次对快速生长的Crabtree阴性酿酒酵母与Crabtree阳性菌株进行转录组比较；系统验证了sZJD-28在多种非乙醇化学品（2,3-丁二醇、乳酸、对香豆酸、法呢烯、番茄红素、3-羟基丙酸、游离脂肪酸）生产中的优势；通过补料分批发酵获得酿酒酵母中最高游离脂肪酸比产量。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28 | 中心碳代谢（乙酰辅酶A供给） | PO/PTA | 丙酮酸氧化酶/磷酸转乙酰酶 | 催化 | 异源途径替代天然PDC，提供乙酰辅酶A，使菌株Crabtree阴性化 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C | 糖酵解/乙醇发酵 | PDC1/PDC5/PDC6 | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | Crabtree阳性参照菌株，产生乙醇导致碳流失 |
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28/CEN.PK113-11C | 2,3-丁二醇合成（丙酮酸节点） | ILV2 | 乙酰乳酸合酶（胞质定位截短体） | 催化 | 过表达用于检测2,3-丁二醇生产能力 |
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28/CEN.PK113-11C | 乳酸合成（丙酮酸节点） | LDH | 乳酸脱氢酶（来自乳酸乳球菌） | 催化 | NADH依赖型，用于消耗胞质NADH |
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28/CEN.PK113-11C | 对香豆酸合成（莽草酸途径） | TAL | 酪氨酸解氨酶（来自黄杆菌属） | 催化 | 将酪氨酸转化为对香豆酸 |
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28/CEN.PK113-11C | 法呢烯合成（甲羟戊酸途径/乙酰乙酰辅酶A节点） | FS | α-法呢烯合酶（来自苹果） | 催化 | 催化FPP转化为法呢烯 |
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28/CEN.PK113-11C | 番茄红素合成（甲羟戊酸途径/乙酰乙酰辅酶A节点） | crtE, crtB, crtI | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱饱和酶（均来自菠萝泛菌） | 催化 | 异源表达合成番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28/CEN.PK113-11C | 3-羟基丙酸合成（丙二酰辅酶A节点） | MCR | 丙二酰辅酶A还原酶（来自橙色绿屈挠菌） | 催化 | 催化丙二酰辅酶A还原为3-羟基丙酸 |
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28/CEN.PK113-11C | 游离脂肪酸合成（丙二酰辅酶A节点） | FAA1, FAA4, POX1, PAH1 | 脂酰辅酶A合成酶1/4、酰基辅酶A氧化酶、磷脂酸磷酸酶 | 催化 | 敲除这些基因以减少脂肪酸降解和脂质合成，促进游离脂肪酸积累 |
| Saccharomyces cerevisiae sZJD-28 | 脂肪酸合成 | ACC1, FAS1, FAS2 | 乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合酶复合体亚基 | 催化 | 转录组显示其表达上调，增强脂肪酸合成能力 |
关键发现
- 转录组分析显示sZJD-28中翻译相关基因下调，碳代谢相关基因显著上调。2,3-丁二醇：28-BD空质粒菌株产量208.4 mg/L，较11C-BD提高13倍以上，比产量提高16.8倍
- ILV2过表达菌株28-BD-E产量292.3 mg/L，较11C-BD-E提高3倍以上，比产量提高4.5倍。乳酸：28-LA产量3.18 g/L，11C-LA峰值1.16 g/L，最大比产量高64.9%。对香豆酸：28-PCA产量270.7 mg/L，较11C-PCA提高67.8%，比产量提高97.5%。法呢烯：28-Far产量较11C-Far提高20.5%。番茄红素：28-Lyc产量34.4 mg/L，较11C-Lyc提高1.88倍，比产量13.51 mg/g DCW。3-羟基丙酸：28-HP产量较11C-HP提高19.2%，比产量提高20.8%。游离脂肪酸：28-FFA产量780.4 mg/L，较11C-FFA提高76.3%，比产量提高71.5%
- 敲除PAH1的28-FFA-E产量1333.2 mg/L，比产量217.7 mg/L/OD
- 补料分批发酵后，28-FFA-E产量达6295.6 mg/L，比产量247.7 mg/L/OD（酿酒酵母最高报道值），脂肪酸含量897.3 mg/g DCW。
研究结论
与Crabtree阳性菌株CEN.PK113-11C相比，Crabtree阴性菌株sZJD-28因碳源和能量流向代谢物合成重定向，转录谱差异显著，在非乙醇化学品生物合成中具有明显优势，可作为有前景的合成生物学底盘细胞。