Coordinately express hemicellulolytic enzymes in Kluyveromyces marxianus to improve the saccharification and ethanol production from corncobs
- 作者
- Qing Lan, Yitong Duan, Pingping Wu, Xueyin Li, Yao Yu, Bo Shi, Jungang Zhou, Hong Lu
- 单位
- State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University; Shanghai Engineering Research Center of Industrial Microorganisms, Fudan University; Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing (SCICB), East China University of Science and Technology; Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2021）
- DOI
- 10.1186/s13068-021-02070-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素中半纤维素阻碍纤维素酶有效降解纤维素，导致糖化效率低、乙醇产量不高。如何在马克斯克鲁维酵母中协调表达多种半纤维素酶，以提高玉米芯的糖化和乙醇生产效率。
研究策略
利用口蹄疫病毒FMDV P2A肽介导的核糖体跳跃，构建多顺反子基因，在马克斯克鲁维酵母中分泌共表达β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶和β-木糖苷酶，并协同商业纤维素酶进行糖化和发酵。
核心内容
该研究在马克斯克鲁维酵母中利用口蹄疫病毒FMDV P2A肽介导的核糖体跳跃，构建多顺反子表达框，实现β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶和β-木糖苷酶的协调分泌共表达，并协同商业纤维素酶用于玉米芯糖化与乙醇发酵。通过添加α-因子信号肽增强下游蛋白分泌效率，构建了共表达两种或三种半纤维素酶的重组菌株。摇瓶培养中，共表达菌株胞外β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶活性最高分别达21.34 U/mL和136.17 U/mL；补料分批发酵中，三酶共表达菌株IMPaXPaR的三种酶活性分别达159.8、2210.5和1.25 U/mL。添加该菌株上清液使DAP玉米芯水解96 h后总可溶性糖提高15.7%，葡萄糖和木糖分别达65.48 g/L和8.45 g/L；高固形物同步糖化发酵中，DAP玉米芯144 h乙醇产量16.4 g/L，较对照提高8.7%，AAP玉米芯120 h乙醇产量14.2 g/L，提高12.7%，木糖含量提高18.2%。研究表明P2A介导的多酶共表达策略可有效提升木质纤维素糖化效率和乙醇产量，为马克斯克鲁维酵母应用于纤维素乙醇生产提供了可行方案。
创新点
首次在马克斯克鲁维酵母中采用FMDV P2A介导的核糖体跳跃实现多种半纤维素酶的协调分泌表达；通过添加α-因子信号肽提高下游蛋白的分泌效率；构建同时表达三种半纤维素酶的重组菌株并应用于玉米芯混合糖化发酵。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Kluyveromyces marxianus | 半纤维素降解与乙醇发酵 | M330 | β-甘露聚糖酶M330 | 催化 | 来源于Bacillus sp. N16-5，负责水解β-甘露聚糖 |
| Kluyveromyces marxianus | 半纤维素降解与乙醇发酵 | Xyn-CD BFV | β-木聚糖酶Xyn-CD BFV | 催化 | 来源于Neocallimastix patriciarum，水解木聚糖 |
| Kluyveromyces marxianus | 半纤维素降解与乙醇发酵 | RuXyn1 | β-D-木糖苷酶RuXyn1 | 催化 | 来源于瘤胃微生物宏基因组，水解木寡糖释放木糖 |
| Kluyveromyces marxianus | 多顺反子表达 | FMDV P2A | P2A自切割肽 | 调控 | 口蹄疫病毒2A肽，介导核糖体跳跃实现多蛋白共翻译切割 |
| Kluyveromyces marxianus | 蛋白分泌 | α-factor信号肽 | α-因子信号肽 | 转运 | 来自酿酒酵母，用于引导下游蛋白分泌 |
| Kluyveromyces marxianus | 糖酵解与乙醇发酵 | INU1启动子 | INU1启动子 | 调控 | 驱动多顺反子基因表达 |
| Kluyveromyces marxianus | 碳源代谢 | 葡萄糖/木糖利用相关基因 | 天然己糖/戊糖代谢酶 | 调控 | 菌株可天然利用葡萄糖、木糖等底物进行乙醇发酵 |
关键发现
- 在摇瓶培养中，IMPaX菌株胞外β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶活性分别为15.50 U/mL和136.17 U/mL
- IMPX菌株分别为21.34 U/mL和42.07 U/mL。在补料分批发酵中，IXPaR菌株胞外β-木聚糖酶和β-木糖苷酶活性分别达1664.2 U/mL和0.90 U/mL
- IMPaXPaR菌株分泌β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶和β-木糖苷酶活性分别达159.8 U/mL、2210.5 U/mL和1.25 U/mL。添加IXPaR菌株上清液使DAP玉米芯水解96 h后总可溶性糖提高15.7%，葡萄糖和木糖分别提高11.2%和11.1%
- 添加IMPaXPaR菌株上清液进一步提高总可溶性糖12.1%（相对IXPaR组），葡萄糖和木糖分别达65.48 g/L和8.45 g/L。HSF实验中，DAP玉米芯144 h乙醇产量为16.4 g/L，比对照提高8.7%
- AAP玉米芯120 h乙醇产量为14.2 g/L，提高12.7%，木糖含量提高18.2%。
研究结论
FMDV P2A在马克斯克鲁维酵母中具有高效的自切割活性，可用于多种酶的分泌共表达；共表达三种半纤维素酶的IMPaXPaR菌株能提高玉米芯的糖化和乙醇产量，是用于木质纤维素乙醇生产的优良菌株。