高级醇 · 代谢工程文献库

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Hydroxylases involved in terpenoid biosynthesis: a review

作者
Zihan Zhang, Qing-Yang Wu, Yue Ge, Zheng-Yu Huang, Ran Hong, Aitao Li, Jian-He Xu, Hui-Lei Yu
单位
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Shanghai Collaborative Innovation Centre for Biomainufacturing, East China University of Science and Technology; CAS Key Laboratory of Synthetic Chemistry of Natural Substances, Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences; School of Life Sciences, State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, Hubei University
杂志
Bioresources and Bioprocessing（2023）
DOI
10.1186/s40643-023-00656-1
所属领域
代谢工程
关键词
BiooxidationCytochrome P450 monooxygenaseHydroxylaseNatural productsTerpenoids
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解决的核心问题

萜类化合物生物合成中，羟基化酶（特别是细胞色素P450）对惰性碳骨架的功能化修饰机制不清、异源表达困难、活性及选择性不足，限制了萜类天然产物的微生物异源合成。

研究策略

系统综述近十年萜类羟化酶（主要P450）的鉴定、分子改造和功能表达研究进展，按单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜分类总结，并构建系统发育树指导新酶挖掘。

研究路线图

100%
研究问题：萜类羟化酶功能不清、异源表达难、活性不足
策略：系统综述近十年萜类羟化酶鉴定、改造与表达
关键改造①：系统发育树指导新羟化酶挖掘
关键改造②：P450 BM3突变体提高区域选择性
关键改造③：异源表达优化解决低表达问题
关键发现：CYP71AV8等新型羟化酶&工程化突变体性能数据
结论：系统发育+蛋白工程+表达优化推动萜类合成生物学
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核心内容

该综述系统梳理了近十年萜类生物合成中羟基化酶，特别是细胞色素P450的研究进展。作者按照单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜等骨架类型分类，总结了羟化酶的鉴定、异源表达和分子改造策略，并构建系统发育树以揭示不同萜类骨架羟化酶与CYP450家族间的进化关联。关键结果表明，序列同源性与底物选择性存在密切对应，例如CYP71AV8与CYP71AV1序列一致性达81%，是首个被证实具有(+)-缬烯烃羟化功能的P450。在蛋白工程方面，P450 BM3双突变体F87A/I263L可实现对β-CBT-二醇C-9位100%的区域选择性羟化，三突变体L75A/V78A/F87G则对C-10位达到97%的区域选择性，展示了定点突变在调控催化特异性上的潜力。此外，多个CYP716A家族成员被证实与CYP716A12类似，均催化C-28位氧化。该工作表明，利用系统发育关系可有效指导新羟化酶的挖掘，而结合异源表达优化与蛋白工程可显著改善P450活性低、选择性不足等问题，为萜类化合物的微生物异源合成提供了重要的酶资源挖掘与改造策略。

创新点

首次系统梳理不同萜类骨架羟化酶与CYP450家族间的进化关联；总结了利用系统发育关系指导挖掘特定底物羟化酶的策略；汇总了P450 BM3突变体等工程化改造提高区域选择性的典型案例。

研究对象（40）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
拟南芥 单萜生物合成 CYP76C1 CYP76C1 催化 芳樟醇羟化酶，催化烯丙位羟化
拟南芥 单萜生物合成 CYP76C2 CYP76C2 催化 香茅醇8-羟化酶，还可催化芳樟醇C-1/C-2环氧化
拟南芥 单萜生物合成 CYP76C4 CYP76C4 催化 芳樟醇羟化酶，兼有环氧化活性
拟南芥 单萜生物合成 CYP76B6 CYP76B6 催化 橙花醇8-羟化酶
拟南芥 单萜生物合成 CYP71B31 CYP71B31 催化 芳樟醇多位点羟化及C-1/C-2环氧化
拟南芥 单萜生物合成 CYP76C3 CYP76C3 催化 芳樟醇羟化，产物多样性
植物来源（薄荷科） 单萜/倍半萜/二萜生物合成 CYP76F45 CYP76F45 催化 同时催化香叶醇、法尼醇、香叶基香叶醇的烯丙位羟化
叶甲 单萜生物合成 CYP6BH5 CYP6BH5 催化 第一个从昆虫鉴定的P450，羟化香叶醇及橙花醇、香茅醇
分枝杆菌HXN-1500 单萜生物合成 CYP153A6 CYP153A6 催化 柠檬烯7-羟化酶，催化L-柠檬烯生成紫苏醇
北美乔柏 单萜生物合成 CYP750B1 CYP750B1 催化 催化(+)-桧烯的烯丙位羟化生成(+)-反式桧醇
北美乔柏 单萜生物合成 CYP76AA25 CYP76AA25 催化 底物谱广，可羟化桧烯、倍半萜法尼烯及除草剂异丙隆
山地松树皮甲虫 单萜生物合成 CYP345E2 CYP345E2 催化 催化α-蒎烯、β-蒎烯和柠檬烯等烯丙位羟化
山地松树皮甲虫 单萜生物合成 CYP6DE1 CYP6DE1 催化 催化α-蒎烯等氧化
山地松树皮甲虫 单萜生物合成 CYP6DE3 CYP6DE3 催化 催化蒎烯等单萜的烯丙位羟化
山地松树皮甲虫 单萜生物合成 CYP6DJ1 CYP6DJ1 催化 特异性催化柠檬烯两个对映体生成环氧化物和紫苏醇，对双环单萜无活性
长春花 单萜吲哚生物碱生物合成 CYP71D12 CYP71D12 催化 高亲和性羟化他波宁C-16位，参与长春质碱合成
长春花 单萜吲哚生物碱生物合成 CYP71D351 CYP71D351 催化 与他波宁C-16羟化同工酶
长春花 单萜吲哚生物碱生物合成 CYP71BJ1 CYP71BJ1 催化 催化他波宁C-19羟化生成19-羟基他波宁
菊科植物（除虫菊） 倍半萜内酯生物合成 CYP71AV2 CYP71AV2 催化 大牻牛儿烯A氧化酶，三步连续氧化C-12甲基生成GAA
莴苣 倍半萜内酯生物合成 CYP71BL2 CYP71BL2 催化 GAA-6-羟化酶
向日葵 倍半萜内酯生物合成 CYP71BL1 CYP71BL1 催化 GAA-8-羟化酶
菜蓟 倍半萜内酯生物合成 CYP71AV9 CYP71AV9 催化 大牻牛儿烯A羟化酶，酸性条件下生成醇和醛
菜蓟 倍半萜内酯生物合成 CYP71BL5 CYP71BL5 催化 木香烃内酯合酶，与CYP71AV9共表达生成木香烃内酯结合物
纤维堆囊菌So ce56 倍半萜生物合成 CYP260A1 CYP260A1 催化 羟化蛇麻烯、朱栾倍半萜等，底物谱广
纤维堆囊菌So ce56 倍半萜生物合成 CYP264B1 CYP264B1 催化 底物谱更宽，区域选择性更高
黄花蒿 倍半萜青蒿素生物合成 CYP71AV1 CYP71AV1 催化 紫穗槐-4,11-二烯单加氧酶，三步连续羟化C-12生成青蒿酸
菊苣 倍半萜生物合成 CYP71AV8 CYP71AV8 催化 首个被证实具有(+)-缬烯烃羟化功能的P450，催化C-2羟化为主，兼有GA和紫穗槐二烯氧化活性
枯草芽孢杆菌 倍半萜生物合成 CYP109B1 CYP109B1 催化 催化缬烯烃C-2连续氧化生成诺卡酮
葡萄 倍半萜生物合成 CYP71BE5 CYP71BE5 催化 催化α-愈创木烯C-2羟化，进一步氧化生成(-)-圆柚酮
酿酒酵母 倍半萜生物合成 CYP71D51V2 CYP71D51V2 催化 催化(+)-缬烯烃氧化生成(+)-诺卡醇为主产物
阿维链霉菌 倍半萜抗生素生物合成 CYP183A1 CYP183A1 催化 催化戊达烯烯丙位羟化生成戊达-13-醇
天蓝色链霉菌A3(2) 倍半萜抗生素生物合成 CYP170A1 CYP170A1 催化 催化表异唑烯连续氧化生成阿尔巴黄酮，兼有法尼烯合酶活性
烟草 二萜西柏三烯醇生物合成 CYP71D16 CYP71D16 催化 催化西柏三烯醇C-6羟化生成西柏三烯二醇
巨大芽孢杆菌 二萜生物合成 CYP102A1 (F87A/I263L) P450 BM3双突变体 催化 催化β-CBT-二醇C-9羟化，区域选择性100%，dr 89:11
巨大芽孢杆菌 二萜生物合成 CYP102A1 (L75A/V78A/F87G) P450 BM3三突变体 催化 催化β-CBT-二醇C-10羟化，区域选择性97%，dr 74:26；也能羟化β-CBT-三醇C-10
蓖麻 二萜麻疯树烷生物合成 CYP726A14 CYP726A14 催化 催化麻疯树烷C-5连续氧化生成5-酮基麻疯树烷和5α-羟基麻疯树烷
蓖麻 二萜麻疯树烷生物合成 CYP726A17 CYP726A17 催化 麻疯树烷5-氧化酶
蓖麻 二萜麻疯树烷生物合成 CYP726A18 CYP726A18 催化 麻疯树烷5-氧化酶
蓖麻 二萜麻疯树烷生物合成 CYP726A16 CYP726A16 催化 自身不能氧化麻疯树烷，但与麻疯树烷合酶及5-氧化酶共表达时可生成5-酮基-7,8-环氧麻疯树烷，推测参与后续环氧化
蓖麻 二萜生物合成 CYP726A15 CYP726A15 催化 连续两步氧化neocombrene的C-5位

关键发现

  1. CYP71AV2与CYP71AV1序列一致性高达86.7%
  2. CYP71AV8与CYP71AV1序列一致性为81%，是首个被证实具有(+)-缬烯烃羟化功能的P450
  3. CYP720B1与CYP720B4序列一致性86%、相似性95%
  4. P450 BM3双突变体F87A/I263L催化β-CBT-二醇C-9位羟化的区域选择性为100%，非对映体比为89:11
  5. 三突变体L75A/V78A/F87G催化β-CBT-二醇C-10位羟化区域选择性97%，dr为74:26
  6. CYP72A63对11-氧代-β-香树脂醇的C-30催化特异性高于CYP72A154
  7. CYP716A94、CYP716AL1、CYP716A175、CYP716A52v2、CYP716A179、CYP716A1、CYP716A2等功能均与CYP716A12类似，催化C-28氧化。

研究结论

萜类羟化酶是萜类骨架修饰的关键酶，不同CYP450家族与底物类型存在进化关联；通过系统发育分析可指导新羟化酶的挖掘；异源表达优化和蛋白工程可改善P450的低表达、低活性和底物混杂等问题，推动萜类化合物的合成生物学应用。