A novel recombinant chimeric bio-adhesive protein consisting of mussel foot protein 3, 5, gas vesicle protein A, and CsgA curli protein expressed in Pichia pastoris
- 作者
- Nazanin Bolghari, Hosein Shahsavarani, Masoumeh Anvari, Hadi Habibollahi
- 杂志
- AMB Express（2022）
- DOI
- 10.1186/s13568-022-01362-5
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
现有手术粘合剂存在细胞毒性、炎症反应、粘附力不足等问题；重组生物粘附蛋白在真核系统中的高效表达和翻译后修饰（酪氨酸转化为DOPA）尚未完全解决。
研究策略
利用毕赤酵母表达系统，将贻贝足蛋白3和5（Mfp3、Mfp5）与气泡囊蛋白A（GvpA）及大肠杆菌卷曲蛋白CsgA融合，通过淀粉样蛋白自组装和DOPA翻译后修饰增强湿态粘附性能，并优化pH等培养条件。
核心内容
针对现有手术粘合剂存在细胞毒性、粘附力不足等问题，本研究在毕赤酵母GS115中构建并表达了由贻贝足蛋白Mfp3、Mfp5与气泡囊蛋白GvpA、大肠杆菌卷曲蛋白CsgA组合而成的两种新型嵌合粘附蛋白。利用毕赤酵母真核系统实现了酪氨酸向DOPA的高效翻译后修饰，并借助GvpA与CsgA的淀粉样纤维特性增强蛋白自组装能力。通过His标签纯化获得纯度达90%的重组蛋白；Mfp5-CsgA和Mfp3-GvpA的最大表达浓度分别达1.85 g/L和1.92 g/L，DOPA转化率分别为73.2%和66.4%，分子量经MALDI-TOF确认约为32 kDa和31 kDa。原子力显微镜显示酸性条件（pH 2.5–2.6）下蛋白粘附力和聚集性更强，且Mfp5-CsgA较Mfp3-GvpA具有更大的结构和更强粘附力。结果表明毕赤酵母是生产此类嵌合粘附蛋白的合适宿主，所得蛋白在湿态下表现出的强粘附性使其在牙科、手术及药物递送等生物医学领域具有应用潜力。
创新点
['首次在毕赤酵母中表达包含Mfp3、Mfp5、GvpA和CsgA的多重组合融合蛋白', '利用真核宿主实现高效酪氨酸到DOPA的翻译后修饰，提高粘附力', '结合GvpA和CsgA的淀粉样纤维特性增强蛋白自组装和结构稳定性']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 重组蛋白表达 | AOX1 | — | 调控 | 甲醇诱导型启动子，用于驱动嵌合蛋白的高水平表达 |
| Pichia pastoris GS115 | 生物粘附蛋白合成 | Mfp3 | Mussel foot protein 3 | 催化 | 含有酪氨酸残基，经翻译后修饰转化为DOPA，提供湿态粘附力 |
| Pichia pastoris GS115 | 生物粘附蛋白合成 | Mfp5 | Mussel foot protein 5 | 催化 | 含有酪氨酸残基，DOPA含量高，增强粘附性能 |
| Pichia pastoris GS115 | 生物粘附蛋白合成 | GvpA | Gas vesicle protein A | 区室化 | 来源于Dolichospermum flos-aquae，形成淀粉样纤维，提供结构支撑和自组装能力 |
| Pichia pastoris GS115 | 生物粘附蛋白合成 | CsgA | Curli protein CsgA | 区室化 | 来源于Escherichia coli，形成淀粉样纤维，增强粘附网络稳定性 |
关键发现
['重组蛋白经His标签纯化后纯度达90%', '最大表达浓度：Mfp5-CsgA为1.85 g/L，Mfp3-GvpA为1.92 g/L（原文单位标注为g/mL，疑为笔误）', 'DOPA转化率：Mfp5-CsgA为73.2%±2.6%，Mfp3-GvpA为66.4%±3.5%', 'Mfp5-CsgA和Mfp3-GvpA的分子量分别约为32 kDa和31 kDa（MALDI-TOF确认）', 'AFM显示酸性条件（pH 2.5-2.6）下蛋白粘附力和聚集性更强', '嵌合蛋白Mfp5-CsgA比Mfp3-GvpA具有更大的结构和更强的粘附力']
研究结论
毕赤酵母可作为一种合适的表达系统用于生产Mfp3、Mfp5、CsgA和GvpA组成的嵌合粘附蛋白，该蛋白在湿态条件下具有强粘附性，有望用于牙科、手术和药物递送等生物医学领域。