Reduced catabolic protein expression in Clostridium butyricum DSM 10702 correlate with reduced 1,3-propanediol synthesis at high glycerol loading

作者: Mine Gungormusler-Yilmaz, Dmitry Shamshurin, Marine Grigoryan, Marcel Taillefer, Victor Spicer, Oleg V Krokhin, Richard Sparling, David B Levin
单位: Department of Biosystems Engineering, Faculty of Engineering, University of Manitoba; Department of Bioengineering, Ege University; Manitoba Centre for Proteomics and Systems Biology, University of Manitoba; Department of Microbiology, University of Manitoba; Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba
杂志: AMB Express（2014）
DOI: 10.1186/s13568-014-0063-6
所属领域: 代谢工程
关键词: 1,3-propanediol synthesisClostridium butyricumGlycerol catabolismMultiple reaction monitoringProteomics
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解决的核心问题

高初始甘油浓度（620 mM）会抑制Clostridium butyricum DSM 10702的生长和1,3-丙二醇（1,3-PDO）合成，但其分子机制尚不清楚，需要解析甘油分解代谢相关蛋白表达水平的变化。

研究策略

利用1D/2D LC/MS/MS和多重反应监测（MRM）定量蛋白质组学技术，比较低（170 mM）和高（620 mM）初始甘油浓度下指数期和稳定期菌体蛋白表达差异，并结合发酵产物分析进行关联。

研究路线图

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核心内容

该研究以丁酸梭菌DSM 10702为对象，利用1D/2D LC-MS/MS结合多重反应监测定量蛋白质组学，比较了低（170 mM）和高（620 mM）初始甘油浓度下指数期与稳定期菌体蛋白表达差异，并关联发酵产物分析。结果显示，高甘油负荷使比生长速率由0.175 h⁻¹降至0.113 h⁻¹，底物利用率由92.1%降至28.3%，1,3-PDO浓度由6.15 g/L降至3.13 g/L，但摩尔产率相近（0.55 vs 0.51 mol/mol）。蛋白质组学揭示，高甘油条件下甘油还原途径的甘油脱水酶激活因子（CBY_0501）及氧化途径的甘油脱氢酶（CBY_3235）、DHA激酶（CBY_0505、CBY_3690）等关键酶表达下调超过2倍，而丁酸合成途径部分蛋白表达上调。这表明高初始甘油浓度通过整体下调甘油分解代谢关键酶表达，减缓细胞生长和底物消耗，进而降低1,3-PDO总产量，但不改变产物对底物的摩尔转化效率。该结果从蛋白质水平解释了高底物抑制机制，为优化甘油发酵工艺及菌株基因工程改造提供了理论依据。

创新点

首次将C. butyricum中甘油分解代谢酶的表达水平与1,3-PDO合成进行关联分析，系统揭示了高甘油负荷下分解代谢蛋白整体下调与生长及产物合成抑制的关系。

研究对象（19）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油还原途径	CBY_0500	1,3-propanediol dehydrogenase	催化	将3-HPA还原为1,3-PDO，再生NAD+
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油还原途径	CBY_0501	glycerol dehydratase activator	调控	激活甘油脱水酶，高甘油下表达下调
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油还原途径	CBY_0502	glycerol dehydratase	催化	甘油脱水生成3-羟基丙醛（3-HPA）
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油氧化途径	CBY_3235	glycerol dehydrogenase	催化	甘油氧化为二羟丙酮（DHA），高甘油下显著下调
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油氧化途径	CBY_0505	dihydroxyacetone kinase (phosphotransfer subunit)	催化	磷酸烯醇式丙酮酸依赖的DHA激酶组分，高甘油下下调
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油氧化途径	CBY_0506	dihydroxyacetone kinase (L subunit)	催化	DHA激酶L亚基，将DHA磷酸化为DHAP
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油氧化途径	CBY_3690	dihydroxyacetone kinase (L subunit)	催化	DHA激酶L亚基，高甘油下表达下调
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油氧化途径	CBY_3691	dihydroxyacetone kinase (DhaK subunit)	催化	DHA激酶催化亚基
Clostridium butyricum DSM 10702	丁酸合成途径	CBY_1290	acetyl-CoA acetyltransferase	催化	乙酰CoA转化为乙酰乙酰CoA
Clostridium butyricum DSM 10702	丁酸合成途径	CBY_3045	3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase	催化	高甘油下表达上调
Clostridium butyricum DSM 10702	丁酸合成途径	CBY_3041	3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase	催化	巴豆酰CoA生成步骤
Clostridium butyricum DSM 10702	丁酸合成途径	CBY_2919	phosphate butyryltransferase	催化	丁酰CoA转化为丁酰磷酸
Clostridium butyricum DSM 10702	丁酸合成途径	CBY_2920	butyrate kinase	催化	丁酰磷酸生成丁酸并产ATP
Clostridium butyricum DSM 10702	乙酸合成途径	CBY_0205	phosphate acetyltransferase	催化	乙酰CoA转化为乙酰磷酸
Clostridium butyricum DSM 10702	乙酸合成途径	CBY_0206	acetate kinase	催化	乙酰磷酸生成乙酸并产ATP
Clostridium butyricum DSM 10702	乳酸合成途径	CBY_0742	L-lactate dehydrogenase	催化	丙酮酸还原为乳酸，高甘油指数期表达上调
Clostridium butyricum DSM 10702	乳酸合成途径	CBY_2341	L-lactate dehydrogenase	催化	乳酸脱氢酶同工酶
Clostridium butyricum DSM 10702	乙醇合成途径	CBY_3753	ethanol dehydrogenase (aldehyde-alcohol dehydrogenase 2)	催化	高甘油下表达上调，但未检测到乙醇净生成
Clostridium butyricum DSM 10702	甘油转运	CBY_9999	glycerol uptake facilitator protein (GlpF)	转运	跨膜甘油通道蛋白，表达量接近检测限

关键发现

高初始甘油浓度（620 mM）使比生长速率从0.175 h-1降至0.113 h-1，底物利用率从92.1%降至28.3%
1,3-PDO浓度由6.15 g/L降至3.13 g/L，但其摩尔产率（0.55 vs 0.51 mol/mol）相近
丁酸摩尔产率分别为0.22和0.18 mol/mol。蛋白质组学显示，高甘油条件下甘油还原途径的CBY_0501（甘油脱水酶激活因子）和氧化途径的CBY_3235（甘油脱氢酶）、CBY_0505及CBY_3690（DHA激酶）等表达降低超过2倍，但丁酸合成途径的CBY_3045、CBY_3753（乙醇脱氢酶）等表达上调。

研究结论

高初始甘油浓度通过降低甘油分解代谢（氧化和还原途径）关键酶的表达，减缓细胞生长和甘油消耗速率，从而降低1,3-PDO总产量，但1,3-PDO相对于底物的摩尔产率基本保持不变。研究结果为优化甘油发酵和基因工程改造提供了蛋白质水平的基础。