An evolved pyrrolysyl-tRNA synthetase with polysubstrate specificity expands the toolbox for engineering enzymes with incorporation of noncanonical amino acids
- 作者
- Ke Liu, Ling Jiang, Shuang Ma, Zhongdi Song, Lun Wang, Qunfeng Zhang, Renhao Xu, Lirong Yang, Jianping Wu, Haoran Yu
- 单位
- Institute of Bioengineering, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University; ZJU-Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Centre; Key Laboratory of Pollution Exposure and Health Intervention of Zhejiang Province, Interdisciplinary Research Academy, Zhejiang Shuren University; Hangzhou 14th Middle School
- 杂志
- Bioresources and Bioprocessing（2023）
- DOI
- 10.1186/s40643-023-00712-w
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
提高多底物特异性的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（PyIRS）变体对非典型氨基酸（ncAAs）的掺入效率，并应用于酶机制研究和酶工程改造。
研究策略
将MmPyIRS(N346A/C348A)的活性相关突变移植到同源MbPyIRS，获得MbPyIRS(N311A/C313A)；通过贪婪组合N端单点突变进行迭代优化，得到高效变体IPE；利用IPE将多种ncAAs位点特异性掺入镧系依赖醇脱氢酶PedH，通过酶学表征与分子动力学模拟评估其对催化性能的影响。
核心内容
本研究通过将活性相关突变从Methanosarcina mazei来源的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（MmPyIRS N346A/C348A）移植至同源的Methanosarcina barkeri来源酶（MbPyIRS），获得MbPyIRS(N311A/C313A)变体，其对12种测试非典型氨基酸的掺入效率均高于亲本。随后通过四轮贪婪组合N端单点突变迭代优化，获得变体IPE（N311A/C313A/V31I/T56P/A100E），总可掺入ncAAs近60种，平均掺入效率较Mb-NA/CA提高6.61倍，其中单突变T56P使多种底物掺入效率提高3—5倍。利用IPE将8种非典型氨基酸位点特异性掺入镧系依赖醇脱氢酶PedH的F412位，发现掺入苯乳酸后催化效率提高1.8倍（kcat/Km从0.136提升至0.243 s⁻¹mM⁻¹），掺入O-叔丁基-L-酪氨酸则赋予酶对(S)-2-丁醇的对映选择性。分子动力学模拟揭示苯乳酸掺入破坏了主链氮与M439硫间氢键从而影响活性。该研究拓展了遗传密码扩展工具，并证明主链原子修饰是酶工程的新策略。
创新点
1. 通过N端工程获得底物混杂性显著增强的PyIRS变体IPE（N311A/C313A/V31I/T56P/A100E），总可掺入ncAAs近60种；2. 首次在蛋白质主链上引入苯乳酸（25）改造PedH，使对甲醇的催化效率提高1.8倍，证明主链原子修饰可用于酶工程；3. 结合分子对接与MD模拟解析了不同噻吩丙氨酸位置异构体活性差异的机制。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 遗传密码扩展（非典型氨基酸掺入） | MbPyIRS (含突变 N311A/C313A 及 N端工程组合) | MbPyIRS (N311A/C313A) 变体、IPE (N311A/C313A/V31I/T56P/A100E) 变体 | 催化 | 吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，催化非典型氨基酸与tRNAPyl的连接 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 遗传密码扩展（非典型氨基酸掺入） | MmPyIRS | MmPyIRS (N346A/C348A) 变体 | 催化 | 同源酶，用于比较掺入效率 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 醇氧化代谢（PQQ依赖的醇脱氢） | pedH | PedH (野生型及F412位掺入非典型氨基酸的突变体，如F412PLA、F412OBT) | 催化 | 镧系依赖的醇脱氢酶，氧化甲醇、乙醇、2-丁醇等 |
关键发现
- ['MbPyIRS(N311A/C313A)对12种测试ncAAs的掺入效率均高于MmPyIRS(N346A/C348A)。', '单突变T56P使ncAA 5、2、1的掺入效率分别提高5.2倍、4.9倍和4.3倍，平均提高3.4倍。', '经四轮贪婪组合获得IPE变体，平均掺入效率比Mb-NA/CA高6.61倍，比IPYE高29.9%。', 'IPE可识别16种新型ncAAs，其中对L-2,3,6-三氟Phe（18）的掺入效率提高最大，为4.9倍
- 对苯乳酸（25）提高5.5倍，对3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸（24）提高2.2倍。', '将8种ncAAs掺入PedH F412位点
- F412PLA使PedH对甲醇的比活从0.056 U/mg提高到0.089 U/mg，Km从1.10 mM降至0.70 mM，kcat从0.15 s^-1升至0.17 s^-1，催化效率kcat/Km提高1.8倍。', 'F412OBT（掺入O-叔丁基-L-酪氨酸）改变了PedH的对映选择性，对(S)-2-丁醇活性高于(R)-2-丁醇，野生型无差异。', '分子动力学模拟表明，苯乳酸掺入破坏了F412主链氮与M439硫之间的氢键，从而影响酶活性。']
研究结论
本研究通过N端工程获得了高活性、宽底物谱的PyIRS变体IPE，扩展了遗传密码扩展工具的应用；利用IPE在PedH中掺入多种ncAAs，证明了主链修饰（如苯乳酸）能改变底物特异性和催化效率，为酶工程提供了新策略。