Toward a cell-free hydantoinase process: screening for expression optimization and one-step purification as well as immobilization of hydantoinase and carbamoylase
- 作者
- Christin Slomka, Georg Paris Späth, Phillip Lemke, Marc Skoupi, Christof M. Niemeyer, Christoph Syddakt, Jens Rudat
- 单位
- Institute of Process Engineering in Life Sciences, Section II: Technical Biology, Karlsruhe Institute of Technology (KIT); Institute of Biological Interfaces (IBG-1), Karlsruhe Institute of Technology (KIT)
- 杂志
- AMB Express（2017）
- DOI
- 10.1186/s13568-017-0420-3
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
全细胞海因酶工艺存在底物/产物跨膜运输限制、细胞内降解副反应以及底物溶解度低等缺点，需要开发无细胞工艺，并要求实现酶的高效表达、简便纯化与固定化。
研究策略
对A. crystallopoietes DSM 20117的海因酶基因进行密码子优化，结合低氧培养、添加乙醇及伴侣蛋白共表达筛选最佳表达条件；比较Ni Sepharose亲和层析与功能化磁珠的纯化效率，并发展直接从粗提物进行酶固定化的方法；考察固定化酶对不同底物的活性。
核心内容
针对全细胞海因酶工艺中底物跨膜运输受限、副反应多及底物溶解度低等问题，本研究构建了无细胞酶催化路线。对A. crystallopoietes来源的海因酶基因进行密码子优化，并结合低氧培养、乙醇添加及伴侣蛋白共表达筛选最佳可溶性表达条件。结果显示，缺氧条件下表达优化型海因酶D-Hyd(co)在90 rpm时比活达149.5 μU/mg cdw，约为天然酶的4.5倍；BioLector筛选确认pH 7、1 mM IPTG与3%乙醇组合可使比活进一步提高至440.7 μU/mg cdw。纯化方面，比较了Ni Sepharose亲和层析与IMAC功能化磁珠两种策略，后者更具优势：D-Carb经磁珠纯化比活达1243.0 mU/mg，纯化126.6倍，均优于传统层析。更重要的是，发展出直接从粗提物固定化酶的方法，固定化海因酶和氨甲酰酶比活分别达105.47 mU/mg和12.91 U/mg，较粗提物提高约200倍和130倍，且显著高于游离纯化酶。该同步纯化与固定化策略简化了操作流程并提升酶性能，为无细胞海因酶工艺合成光学纯α-氨基酸提供了可行基础。
创新点
首次利用IMAC功能化磁珠直接从粗提物固定化海因酶和氨甲酰酶，省去预纯化步骤；固定化酶的比活力远高于游离纯化酶；确立了低氧及乙醇添加对海因酶表达的正向效应。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21DE3 | 海因酶过程 | D-hydantoinase gene (native) | D-Hyd | 催化 | C端组氨酸标签；原始序列海因酶 |
| Escherichia coli BL21DE3 | 海因酶过程 | codon-optimized hydantoinase gene (D-Hyd(co)) | D-Hyd(co) | 催化 | C端组氨酸标签和N端SBP标签；基因登录号KY684077 |
| Escherichia coli BW 3110 | 海因酶过程 | N-carbamoylase gene (from pMW1) | D-Carb | 催化 | C端组氨酸标签；催化N-氨甲酰氨基酸水解 |
关键发现
- 缺氧条件下表达D-Hyd(co)在90 rpm时获得最高比活149.5 μU/mg cdw，而D-Hyd仅33.4 μU/mg cdw
- BioLector筛选显示pH 7+1 mM IPTG+3%乙醇时D-Hyd(co)比活最高440.7 μU/mg cdw
- Ni Sepharose纯化D-Hyd(co)洗脱2比活20.1 mU/mg，回收6.5%，纯化18.8倍，D-Carb洗脱1比活554.9 mU/mg，回收44.2%，纯化33.0倍
- 磁性微珠纯化D-Hyd(co)比活46.4 mU/mg，回收11.9%，纯化35.9倍，D-Carb比活1243.0 mU/mg，回收32.5%，纯化126.6倍
- 固定化D-Hyd(co)对HMH比活最高105.47 mU/mg，固定化D-Carb对NCPheAla比活最高12.91 U/mg，固定化酶比粗提物提高约200倍（海因酶）和130倍（氨甲酰酶）。
研究结论
本研究通过密码子优化和表达条件筛选显著提高了海因酶可溶性表达，并成功建立基于功能化磁珠的同步纯化/固定化方法，固定化酶活性高、稳定性好，为无细胞海因酶工艺合成光学纯α-氨基酸奠定了基础。