Dual Engineering of Olivetolic Acid Cyclase and Tetraketide Synthase for the Formation of Longer Alkyl-Chain Olivetolic Acid Analogs and Their Antibacterial Activities
- 作者
- Hiroyuki Morita
- 单位
- Institute of Natural Medicine, University of Toyama, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japan
- 杂志
- Chem. Pharm. Bull.（2023）
- DOI
- 10.1248/cpb.c23-00692
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型橄榄醇酸环化酶（OAC）和四酮合酶（TKS）无法利用长链（C8以上）脂肪酰辅酶A生成更长烷基链的橄榄醇酸类似物，限制了新型大麻素类似物的生物合成。
研究策略
基于晶体结构指导的定点突变：通过OAC的F24I突变扩展疏水结合口袋，通过TKS的L190G突变连接活性位点与隐藏口袋，以扩展底物特异性至C12；采用体外共孵育实验和抗菌活性测定。
核心内容
本研究通过晶体结构引导的双酶定点突变策略，对橄榄醇酸环化酶（OAC）和四酮合酶（TKS）进行协同改造，以拓展其底物特异性至长链脂肪酰辅酶A。首先解析了OAC与戊基底物类似物的复合物结构（1.70 Å），鉴定出9 Å深的戊基结合口袋；在此基础上，OAC的F24I突变将口袋深度扩展至12 Å，可容纳庚基和壬基。同时，TKS的L190G突变使活性位点腔延伸至与植物戊基合酶相当的水平。将上述两个突变体组合使用，3d产物活性提高约10倍，并首次生成C11链长的3e产物（2,4-二羟基-6-十一烷基苯甲酸）。抗菌活性测试显示，烷基链长度与活性呈正相关，3e和3f对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度均达2.5 μM，对金黄色葡萄球菌均为6.25 μM。该双酶结构导向工程策略成功将底物特异性扩展至C12，为新型大麻素类似物的生物合成及抗菌药物开发提供了可行路径。
创新点
首次实现OAC和TKS的双酶结构导向工程，使底物特异性扩展至十二烷酰-CoA，生成了C6-C12烷基链橄榄醇酸类似物（3c-3e）；揭示了烷基链长度对抗菌活性的构效关系。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 大麻素生物合成 | TKS | 四酮合酶（Tetraketide synthase） | 催化 | 野生型及L190G突变体；L190G突变扩展活性位点腔，使其能接受更长烷基酰基-CoA（至C12） |
| Escherichia coli | 大麻素生物合成 | OAC | 橄榄醇酸环化酶（Olivetolic acid cyclase） | 催化 | 野生型及F24I/F24L等突变体；F24I突变体将戊基结合口袋深度从9Å延伸至12Å，可容纳C8-C12烷基链 |
| — | 大麻素生物合成 | NphB | 香叶基转移酶（NphB G286S/Y288N双突变体） | 催化 | 用于半合成2系列化合物的区域特异性香叶基化 |
关键发现
- 解析了OAC与3b复合物晶体结构（1.70 Å，PDB:5B09），鉴定出9Å长的戊基结合口袋及催化残基His78/Tyr72
- OAC Y27F突变使3b形成活性提高62%
- OAC F24I突变体将戊基结合口袋深度扩展至12Å，其与3c、3d的复合物结构（PDB:7W6E、7W6F）显示可容纳庚基/壬基
- TKS L190G突变体晶体结构（2.10 Å，PDB:7W6G）显示活性位点腔延伸至与OKS相当
- TKS L190G与OAC F24I突变体组合可使3d活性提高约10倍，并唯一产生3e（2,4-二羟基-6-十一烷基苯甲酸）
- 抗菌活性：3a和3b无活性（MIC>200 μM），3c-f随链长增加活性增强，其中3e和3f对B. subtilis的MIC均为2.5 μM，对S. aureus均为6.25 μM；2c对B. subtilis的MIC为1.25 μM；1b和1c对S. aureus的MIC为2.5 μM。
研究结论
结构引导的双酶工程成功扩展了TKS和OAC的底物特异性，可产生更长烷基链的橄榄醇酸类似物，且这些化合物的抗菌活性与烷基链长度相关，为开发新型大麻素类似物和抗菌药物提供了可行策略。