Cloning, Yeast Expression, and Characterization of a \(\beta\) -Amyrin C-28 Oxidase (CYP716A249) Involved in Triterpenoid Biosynthesis in Polygala tenuifolia
- 作者
- Fu-Sheng Zhang, Xuan Zhang, Qian-Yu Wang, Ya-Jie Pu, Chen-Hui Du, Xue-Mei Qin, Hong-Ling Tian, Yun-Lan Lian, Min-Sheng Li, Yu Chen, Cun-Gen Ma
- 单位
- Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University; College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University; Shanxi University of Chinese Medicine; Research Institute of Economics Crop Shanxi Academy of Agriculture Science; Shanxi Institute for Food and Drug Control
- 杂志
- Biological & Pharmaceutical Bulletin（2020）
- DOI
- 10.1248/bpb.b20-00343
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明细叶远志中三萜皂苷生物合成中关键氧化酶CYP716A249的功能，即催化β-amyrin C-28位氧化生成齐墩果酸。
研究策略
克隆远志CYP716A249基因，结合系统发育分析预测其C-28氧化酶功能；在酿酒酵母中构建β-amyrin合成菌株，再共表达CYP716A249与CPR，通过GC-MS和UHPLC-Q-Orbitrap HRMS检测产物验证功能。
核心内容
该研究首次从细叶远志中克隆并鉴定了三萜皂苷生物合成关键酶CYP716A249。研究团队结合系统发育分析预测其为β-amyrin C-28氧化酶，并在酿酒酵母W303a中构建了共表达β-amyrin合酶、CYP716A249与NADPH-细胞色素P450还原酶的菌株，通过GC-MS和UHPLC-Q-Orbitrap HRMS验证酶功能。结果表明，重组菌株R-BE-20和R-BPE-20分别在26.010 min和26.149 min检测到β-amyrin三甲基硅烷醚峰，而野生型无此信号；在R-BPE-20中检测到齐墩果酸，其特征碎片为m/z 439.36和457.37，证明该酶催化β-amyrin C-28位氧化生成齐墩果酸。组织表达分析显示，CYP716A249在2年生远志根中表达量最高。该工作填补了细叶远志三萜皂苷合成途径中关键氧化步骤的空白，为后续异源生产皂苷类活性成分奠定酶学基础。
创新点
首次鉴定并验证了细叶远志中的CYP716A249为β-amyrin C-28氧化酶，填补了该植物三萜皂苷生物合成途径中的关键酶学步骤空白。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae W303a | 三萜皂苷生物合成（MVA途径） | CYP716A249 | CYP716A249 (β-amyrin C-28 oxidase) | 催化 | 来自Polygala tenuifolia，催化β-amyrin C-28位氧化生成齐墩果酸 |
| Saccharomyces cerevisiae W303a | 三萜皂苷生物合成（MVA途径） | Ggb4S (β-AS) | β-amyrin synthase | 催化 | 来自Glycyrrhiza glabra，催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-amyrin |
| Saccharomyces cerevisiae W303a | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶（FPPS） | 催化 | 酿酒酵母内源基因，参与IPP和DMAPP缩合生成FPP，增强前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae W303a | 三萜皂苷生物合成（P450催化系统） | LjCPR | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 来自Lotus japonicus，为CYP716A249提供电子，支持其催化活性 |
关键发现
- CYP716A249在2年生远志根中表达量最高，组织表达顺序为根>花>叶>茎（1-2年生）或根>花>茎>叶（3年生）；构建的菌株R-BE-20和R-BPE-20经GC-MS检测，分别在26.010 min和26.149 min出现β-amyrin三甲基硅烷醚峰（m/z
- 0），而野生型W303a无此峰；UHPLC-Q-Orbitrap HRMS检测到R-BPE-20中齐墩果酸（OA）的保留时间为2.91 min（标准品3.01 min），质谱碎片m/z
- 36 [M-H2O+H]+和457.37 [M+H]+，证明CYP716A249催化β-amyrin C-28位氧化生成OA。
研究结论
CYP716A249是细叶远志中参与三萜皂苷生物合成的β-amyrin C-28氧化酶，能够催化β-amyrin氧化生成齐墩果酸，为深入解析细叶远志皂苷生物合成途径奠定了基础。