Metabolism of Ginsenoside Rb1 by Human Intestinal Microflora and Cloning of Its Metabolizing β-D-Glucosidase from Bifidobacterium longum H-1
- 作者
- Il-Hoon Jung, Jeong Hoon Lee, Yang-Jin Hyun, Dong-Hyun Kim
- 单位
- 韩国庆熙大学药学院生命与纳米药学系，首尔130-701，韩国
- 杂志
- Biological & Pharmaceutical Bulletin（2012）
- DOI
- 10.1248/bpb.35.573
- 所属领域
- 微生物代谢与生物转化
- 关键词
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解决的核心问题
阐明肠道菌群在人参皂苷Rb1药理效应表达中的作用，并克隆其代谢关键酶β-D-葡萄糖苷酶进行酶学表征。
研究策略
测量148份人粪便标本的β-葡萄糖苷酶活性及人参皂苷Rb1代谢活性，从Bifidobacterium longum H-1中克隆bglX基因，在大肠杆菌中异源表达、纯化，研究其底物特异性和动力学参数。
核心内容
该研究旨在阐明人肠道菌群在人参皂苷Rb1药理效应表达中的作用，并克隆其代谢关键酶。研究者测定了148份人粪便标本的β-葡萄糖苷酶活性，发现其对p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷的平均活性为0.097 μmol/min/mg，对人参皂苷Rb1的平均代谢活性为0.311 pmol/min/mg，且无性别和年龄差异。随后从长双歧杆菌H-1中克隆了bglX基因，其开放阅读框长2364 bp，编码787个氨基酸，预测分子量95 kDa。重组酶经大肠杆菌异源表达和纯化后，比活达21.96 μmol/min/mg，最适pH为5.5，最适温度35–37°C。底物特异性分析显示该酶对牛蒡子苷、马钱苷、熊果苷和人参皂苷Rb1的相对活性分别为26.1%、11.0%、16.3%和1.2%，但不能水解C-糖苷。动力学参数方面，对人参皂苷Rb1的Km为4.33 mM，Vmax为4.08 μmol/min/mg。该酶能特异水解多种天然O-β-D-糖苷，将人参皂苷Rb1转化为Rd、马钱苷转化为马钱子苷元等。结果表明，肠道菌群来源的exo-β-葡萄糖苷酶在人参皂苷Rb1代谢中发挥关键作用，该酶可用于相关活性代谢物的生物制备。
创新点
首次从长双歧杆菌H-1中克隆并表达β-D-葡萄糖苷酶（BglX）；证明该酶能特异水解多种天然O-β-D-糖苷（如人参皂苷Rb1、马钱苷、牛蒡子苷、熊果苷），且具有exo-型水解活性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 人肠道菌群（粪便标本） | 人参皂苷Rb1代谢 | — | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 148份粪便标本测活，平均活性0.311 pmol/min/mg |
| Bifidobacterium longum H-1 | 人参皂苷Rb1代谢 | bglX | BglX（β-D-葡萄糖苷酶） | 催化 | 克隆来源，ORF 2364bp，编码787氨基酸 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | bglX | 重组rBglX | 催化 | pET-39b(+)载体，T7启动子表达 |
关键发现
- 148份粪便标本中，β-葡萄糖苷酶对p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷平均活性为0.097±0.059 μmol/min/mg，人参皂苷Rb1代谢平均活性为0.311±0.118 pmol/min/mg，男女及年龄间无显著差异。克隆的bglX基因ORF长2364 bp，编码787个氨基酸，预测分子量95 kDa。重组BglX经纯化比活达21.96 μmol/min/mg，纯化13倍。最适pH
- 5，最适温度35-37°C；Cu²⁺和Ni²⁺可抑制酶活。底物特异性：对pNPG活性为100%，对牛蒡子苷26.1%、马钱苷11.0%、熊果苷16.3%、人参皂苷Rb1
- 2%；不能水解C-糖苷（芒果苷、葛根素等）。动力学参数：对pNPG的Km=0.83 mM、Vmax=56.50 μmol/min/mg；对牛蒡子苷Km=1.62 mM、Vmax=20.31 μmol/min/mg；对马钱苷Km=1.92 mM、Vmax=11.68 μmol/min/mg；对人参皂苷Rb1的Km=4.33 mM、Vmax=4.08 μmol/min/mg。该酶可将人参皂苷Rb1转化为Rd，马钱苷转化为马钱子苷元，牛蒡子苷转化为牛蒡子苷元，熊果苷转化为氢醌。
研究结论
肠道菌群产生的exo-β-D-葡萄糖苷酶在人参皂苷Rb1的代谢及其药理效应表达中发挥关键作用。克隆自B.longum H-1的BglX酶具有明确的底物特异性，可高效转化多种天然O-糖苷，可用于相关活性代谢物的制备。