Bacterial Synthesis of Diverse Indole Terpene Alkaloids by an Unparalleled Cyclization Sequence
- 作者
- Zhongli Xu, Martin Baunach, Ling Ding, Christian Hertweck
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2012）
- DOI
- 10.1002/anie.201204087
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
揭示细菌中吲哚萜类生物碱（如xiamycin和sespenine）生物合成的分子机制及其独特环化序列
研究策略
采用基因组挖掘、基因簇克隆、异源表达（在Streptomyces albus中）、靶向基因敲除突变、系统发育分析和代谢物谱分析等方法，对红树林内生菌Streptomyces sp. HKI0576的xiamycin生物合成基因簇进行功能解析
研究路线图
核心内容
本研究通过基因组挖掘与异源重构，系统解析了红树林内生菌Streptomyces sp. HKI0576中吲哚萜类生物碱xiamycin和sespenine的生物合成机制。研究克隆了21.3 kb的xiamycin基因簇（pXU511），并在Streptomyces albus中异源表达，成功产生xiamycin A、xiamycin B、indosepene和sespenine四种主要产物，产量与野生型相当。通过靶向基因敲除，发现杂合酶XiaL（FAD依赖环氧酶与色氨酸2,3-双加氧酶结构域融合）和膜结合萜烯环化酶XiaE为细菌中首次功能鉴定的新型环化酶，而吲哚加氧酶XiaF则首次被证实启动吲哚萜环化。敲除ΔxiaL、ΔxiaE和ΔxiaF完全丧失相应产物，ΔxiaF积累中间体indosepene。此外，异源表达还发现了两种新的N-N和C-N连接xiamycin二聚体（分子式均为C46H48N2O6）。该研究阐明了前所未有的双环化序列机制，为利用细菌生产吲哚萜类化合物奠定了遗传基础。
创新点
首次阐明细菌中吲哚倍半萜生物合成的完整基因簇；发现并鉴定了新型杂合酶XiaL（FAD依赖环氧酶与色氨酸2,3-双加氧酶结构域融合）；首次功能鉴定XiaE为细菌中新型膜结合萜烯环化酶；首次发现吲哚加氧酶XiaF启动吲哚萜环化；通过异源表达发现新的N-N和C-N连接xiamycin二聚体
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces sp. HKI0576 | 吲哚倍半萜生物合成 | xiaK, xiaM | XiaK, XiaM（聚异戊二烯二磷酸合成酶） | 催化 | 参与FPP合成和吲哚异戊二烯基化，可部分功能互补 |
| Streptomyces sp. HKI0576 | 吲哚倍半萜生物合成 | xiaL | XiaL（杂合环氧酶/加氧酶） | 催化 | 预测催化法尼基环氧化，含UbiH样环氧酶结构域和色氨酸2,3-双加氧酶N端结构域 |
| Streptomyces sp. HKI0576 | 吲哚倍半萜生物合成 | xiaE | XiaE（膜结合萜烯环化酶） | 催化 | 新型环化酶，催化环氧法尼基侧链环化 |
| Streptomyces sp. HKI0576 | 吲哚倍半萜生物合成 | xiaF | XiaF（吲哚加氧酶/ACAD家族） | 催化 | 催化吲哚氧化进而启动环化，对生成xiamycin和sespenine必需 |
| Streptomyces sp. HKI0576 | 吲哚倍半萜生物合成 | xiaJ | XiaJ（单加氧酶） | 催化 | 参与吲哚色烯4的甲基氧化形成羧基 |
| Streptomyces sp. HKI0576 | 吲哚倍半萜生物合成 | xiaI | XiaI（铁氧还蛋白） | 能量供给 | 为XiaJ提供电子传递 |
| Streptomyces sp. HKI0576 | 吲哚倍半萜生物合成 | xiaN, xiaO | XiaN, XiaO（转录调控因子） | 调控 | 基因簇中的调控基因，替换为组成型启动子提高产量 |
| Streptomyces albus | 吲哚倍半萜生物合成 | xiaA-xiaO | XiaA-XiaO蛋白 | 催化 | 异源表达宿主，用于重构完整途径 |
关键发现
- 异源表达pXU472在S. albus中产生xiamycin A（2，C23H25NO3，m/z
- 176 [M-H]-）、xiamycin B（3，C23H25NO4，m/z
- 171 [M-H]-）、indosepene（4，C23H29NO3，m/z
- 207 [M-H]-）和sespenine（5，C23H29NO4，m/z
- 217 [M+H]+）
- 3 kb的pXU511足以驱动四种IST产生且水平与野生型相当；组成型表达pXU515显著提高2-5产量；ΔxiaL、ΔxiaE和ΔxiaF突变完全丧失相应产物（ΔxiaF积累4）；ΔxiaJ和ΔxiaI失去4；ΔxiaK和ΔxiaM仍产生少量2；新发现二聚体6a/6b和7分子式均为C46H48N2O6；XiaE是细菌中首个功能表征的新型萜烯环化酶；XiaF是首个被证实启动吲哚萜环化的吲哚加氧酶
研究结论
通过遗传分析和异源重构，阐明了红树林内生菌中吲哚倍半萜生物合成的完整途径，包括两个聚异戊二烯合成酶、一个杂合环氧酶和两种新型环化酶（XiaE和XiaF）的作用，并发现了新的二聚体产物。该研究为细菌中生产吲哚萜类化合物奠定了基础，并揭示了前所未有的环化机制。