Reductive Dehydroxylation of Allyl Alcohols by IspH Protein
- 作者
- Tobias Gräwert, Ingrid Span, Adelbert Bacher, Michael Groll
- 单位
- Technische Universität München
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2010）
- DOI
- 10.1002/anie.201000833
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
IspH蛋白催化的非甲羟戊酸途径最后一步反应——烯丙醇的还原性脱羟基——的结构与机制尚不清楚，需要阐明其催化机理、铁硫簇的作用以及构象变化的动态过程。
研究策略
本文综合评述了IspH蛋白的X射线晶体结构、位点突变、底物类似物、立体化学研究、光谱学分析以及利用X射线诱导光电子驱动晶体中反应等多种方法，提出了详细的催化反应机制。
研究路线图
核心内容
该研究综合运用X射线晶体学、位点突变、底物类似物、立体化学与光谱学方法，系统阐明了IspH蛋白催化烯丙醇还原性脱羟基的反应机制。IspH蛋白含[4Fe-4S]簇，将底物HMBPP转化为IPP与DMAPP的混合物，产物比为6:1，远高于热力学平衡比1:3，表明酶催化偏离平衡控制；氟代底物类似物同样可反应，产物比7:1。立体化学实验显示氘在D2O中专一地掺入IPP的C3-H5i位，提示反应涉及C-O键杂裂解形成烯丙基自由基/负离子中间体。E126Q突变使酶活性下降至少100倍，催化常数kcat为11.6 min⁻¹，KM小于15 μM。晶体结构捕获到Fe-O键长2.0 Å、Fe与C2/C3距离2.8/2.9 Å的反应后期中间体快照，并揭示IspH存在“胡桃夹子”式开放-闭合构象转变。该机制强调蛋白构象运动、排除水和中间体质子化的协同作用，界定了非甲羟戊酸途径最后一步的催化原理。鉴于该途径是结核分枝杆菌和疟原虫顶质体唯一的异戊二烯来源，IspH可作为抗结核、抗疟疾药物开发的潜在靶点。
创新点
提出了一个涉及[4Fe-4S]簇的详细反应机制，包括通过杂裂解断裂C-O键形成烯丙基自由基/负离子中间体，以及IspH蛋白的“胡桃夹子”式开放-闭合构象转变；利用CuKα辐射产生的光电子在晶体中推动反应前行，获得了反应后期中间体的结构快照。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 (MEP pathway) | ispH | IspH | 催化 | 催化HMBPP还原脱羟基生成IPP和DMAPP（比例6:1），具有[4Fe-4S]或[3Fe-4S]簇，呈闭合构象 |
| Aquifex aeolicus | 非甲羟戊酸途径 (MEP pathway) | ispH | IspH | 催化 | 提供开放构象结构（PDB:3DNF），含[3Fe-4S]簇，D3结构域倾斜约20° |
| Thermosynechocystis elongatus | 非甲羟戊酸途径 (MEP pathway) | ispG | IspG | 催化 | 催化MECPP还原开环生成HMBPP，与ferredoxin形成复合物并接受电子 |
| Plasmodium falciparum | 非甲羟戊酸途径 (MEP pathway) | ispH | IspH | 催化 | ferredoxin可为其提供电子 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 (MEP pathway) | — | flavodoxin | 能量供给 | 与flavodoxin reductase组成电子传递链，为IspG/IspH供给还原力 |
| Thermosynechocystis elongatus / Plasmodium falciparum | 非甲羟戊酸途径 (MEP pathway) | — | ferredoxin | 能量供给 | 作为IspG/IspH的电子供体 |
| Escherichia coli | 非甲羟戊酸途径 (MEP pathway) | dxr | IspC (Dxr) | 催化 | 催化DXP异构化还原生成MEP |
关键发现
- IspH蛋白将HMBPP(6)转化为6:1的IPP与DMAPP混合物，而热力学平衡比为1:3
- 氟代底物类似物12也能反应，产物比7:1，表明反应轨迹相同
- 在D2O中氘立体专一地掺入IPP的C3-H5i位
- E126Q突变使IspH活性降低至少100倍
- kcat=11.6 min⁻¹，KM<15 μM（底物6）
- Fe-O键长2.0 Å，Fe与C2/C3距离分别为2.8/2.9 Å，而范德华距离约3.6 Å
- Aquifex aeolicus IspH的D3结构域相对E. coli倾斜约20°
- E. coli IspH各晶体结构RMSD<0.4 Å
- 缺失11个N端或30个C端氨基酸导致蛋白不可溶。
研究结论
IspH蛋白的催化依赖于蛋白构象运动、排除水和中间体质子化的三重协同作用，类似于苜蓿查尔酮异构酶；非甲羟戊酸途径是多数病原菌和疟原虫顶质体唯一的异戊二烯来源，因此该途径酶类（包括IspH）是治疗结核病和疟疾等重大疾病的潜在药物靶点。