Novel Cyclohexyl Meroterpenes Produced by Combinatorial Biosynthesis
- 作者
- Jinyan Jiang, Xinyang Li, Takahiro Mori, Takayoshi Awakawa, Ikuro Abe
- 单位
- Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo; Collaborative Research Institute for Innovative Microbiology, The University of Tokyo; PRESTO, Japan Science and Technology Agency
- 杂志
- Chemical and Pharmaceutical Bulletin（2021）
- DOI
- 10.1248/cpb.c21-00123
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
真菌meroterpenoid中萜烯环化酶（TPC）对非天然底物的底物范围和反应性缺乏研究，难以利用组合生物学生产非天然新颖meroterpene骨架。
研究策略
在米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1中，将产生TPC底物(10'R)-epoxyfarnesyl-DMOA甲酯的酶系（AndM、Nvfb、Trt5、Trt8）分别与功能不同的TPC（Pyr4、AscF、AndB、CdmG）共表达，筛选和鉴定新产物。
核心内容
本研究在米曲霉NSAR1中采用组合生物合成策略，将能够产生萜烯环化酶非天然底物(10'R)-epoxyfarnesyl-DMOA甲酯的酶系（AndM、Nvfb、Trt5、Trt8）分别与四种功能不同的萜烯环化酶（Pyr4、AscF、AndB、CdmG）共表达，以探索环化酶对非天然底物的底物范围和反应性。结果显示，所有测试的环化酶均将非天然底物转化为两个新颖的环己基meroterpene产物，即化合物3和4，其中3的分子式为C26H30O6（[M-H]- 447.2785），4的分子式为C26H37O5（[M-H]- 429.2653）。从10 L培养物中分别分离得到1.2 mg化合物3和0.7 mg化合物4。结构解析表明两者均为单环化产物，3中C-6'和C-7'为R,R绝对构型，4含有环外亚甲基。产物生成源于部分环化的阳离子中间体分别经水淬灭或质子消除。所有环化酶产生相同产物，说明相反的环氧立体化学和聚酮核心差异阻碍了底物在活性位点的正确折叠，导致环化不完全。这是首次报道meroterpenoid萜烯环化酶对非天然底物产生单环化产物，揭示了其底物容忍性和立体化学选择性，为组合生物学生产非天然meroterpene骨架及药物发现奠定了基础，但需进一步工程改造环化酶和优化宿主代谢以提高产量。
创新点
首次报道meroterpenoid TPC对非天然底物产生单环化产物；所有测试的TPC均产生相同的两个新颖环己基meroterpene产物；揭示了TPC对非天然底物的底物容忍性和立体化学选择性。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 真菌meroterpenoid生物合成 | andM | AndM | 催化 | 聚酮合酶（PKS），催化合成DMOA聚酮核心 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 真菌meroterpenoid生物合成 | nvbB | Nvfb | 催化 | 异戊烯基转移酶（PT），催化异戊烯基转移 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 真菌meroterpenoid生物合成 | trt5 | Trt5 | 催化 | 甲基转移酶（MT），催化甲基化 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 真菌meroterpenoid生物合成 | trt8 | Trt8 | 催化 | 黄素依赖单加氧酶（FMO），催化环氧化 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 真菌meroterpenoid生物合成 | pyr4 | Pyr4 | 催化 | 萜烯环化酶（TPC），来自pyripyropene A生物合成 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 真菌meroterpenoid生物合成 | ascF | AscF | 催化 | 萜烯环化酶（TPC），来自ascochlorin生物合成 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 真菌meroterpenoid生物合成 | andB | AndB | 催化 | 萜烯环化酶（TPC），来自anditomin生物合成 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 真菌meroterpenoid生物合成 | cdmG | CdmG | 催化 | 萜烯环化酶（TPC），来自chrodrimanin生物合成 |
关键发现
- 从10L DPY培养物中分离得到1.2 mg化合物3和0.7 mg化合物4；HR-MS显示3的分子式为C26H30O6（[M-H]-
- 2785），4的分子式为C26H37O5（[M-H]-
- 2653）；3和4均为单环化产物，其中3中C-6'和C-7'绝对构型为R,R；4含环外亚甲基（1H NMR
- 49和4.82 ppm，13C
- 6 ppm）；产物3和4由部分环化的阳离子中间体分别经水淬灭（路径A）或质子消除（路径B）生成；所有测试TPC对非天然(10'R)底物均产生相同产物，表明相反的环氧立体化学和聚酮核心差异阻碍了底物在酶活性位点的正确折叠，导致不完全环化。
研究结论
组合生物合成可产生非天然新颖环己基meroterpene，为构建实用合成生物学平台和未来药物发现提供基础；需进一步工程改造TPC和优化宿主代谢以提高产量。