Cloning and Functional Analysis of a β-Amyrin Synthase Gene Associated with Oleanolic Acid Biosynthesis in Gentiana straminea MAXIM.
- 作者
- Yanling LIU, Yunfei CAI, Zhongjuan ZHAO, Junfeng WANG, Jing LI, Wei XIN, Guangmin XIA, Fengning XIANG
- 单位
- The Key Laboratory of Plant Cell Engineering and Germplasm Innovation, Ministry of Education, School of Life Science, Shandong University; Department of Bioscience and Biotechnology, Shandong Institute of Education; College of Pharmaceutical Science, Nankai University
- 杂志
- Biological and Pharmaceutical Bulletin（2009）
- DOI
- 10.1248/bpb.32.818
- 所属领域
- 植物次生代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并功能验证麻花艽（Gentiana straminea）中参与齐墩果酸生物合成的β-香树脂合酶基因GsAS1，并研究其在茉莉酸甲酯（MeJA）诱导下的表达与齐墩果酸积累的关系，为通过代谢工程提高齐墩果酸产量提供基因资源。
研究策略
基于同源保守区域设计简并引物，通过PCR和RACE克隆GsAS1全长cDNA；进行序列比对和系统发育分析；在大肠杆菌和毕赤酵母中异源表达，通过SDS-PAGE、Western blot和GC-EI-MS鉴定产物；利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR分析组织表达模式及MeJA诱导下的时间动态；用HPLC定量齐墩果酸含量变化。
核心内容
该研究从药用植物麻花艽中克隆并功能验证了一个参与齐墩果酸生物合成的β-香树脂合酶基因GsAS1。作者基于同源保守区域设计简并引物，通过PCR和RACE技术获得全长cDNA，其开放阅读框长2268 bp，编码756个氨基酸，与人参β-香树脂合酶同源性达76.2%，且含有四个QW基序和一个DCTAE基序。将GsAS1分别在大肠杆菌和毕赤酵母中异源表达，通过GC-EI-MS鉴定确认其催化产物为β-香树脂，证明该基因编码单功能β-香树脂合酶。组织表达分析显示，GsAS1在叶片中的表达量分别是根部和茎部的4.5倍和2.8倍。经0.1 mM茉莉酸甲酯处理后，GsAS1转录水平在24至48小时达到峰值，同时齐墩果酸含量从未处理组的0.2至0.3 mg/g上升至最高1.2 mg/g，提高约6倍。结果表明，GsAS1是麻花艽齐墩果酸生物合成途径的关键酶，其表达与产物积累呈正相关，可作为代谢工程改造以提高齐墩果酸产量的重要靶点。
创新点
首次从麻花艽中克隆得到β-香树脂合酶基因GsAS1，并通过异源表达证明其编码单功能β-香树脂合酶；阐明了GsAS1表达与齐墩果酸积累在MeJA诱导下的协同响应关系。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 异戊二烯途径/三萜生物合成 | GsAS1 | β-香树脂合酶（β-amyrin synthase） | 催化 | 用于异源表达，产生约88 kDa重组蛋白 |
| 毕赤酵母X-33 | 异戊二烯途径/三萜生物合成 | GsAS1 | β-香树脂合酶（β-amyrin synthase） | 催化 | 异源表达后催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-香树脂，GC-MS验证 |
关键发现
- GsAS1的开放阅读框长2268 bp，编码756个氨基酸，与Panax ginseng β-香树脂合酶同源性为76.2%
- 基因含有四个QW基序和一个DCTAE基序
- 在大肠杆菌中表达出约88 kDa的His标签融合蛋白
- 在毕赤酵母中表达的产物经GC-EI-MS确认为β-香树脂，保留时间为15.20 min
- GsAS1在叶片中的表达量是根部的4.5倍，是茎部的2.8倍
- 经0.1 mM MeJA处理后，GsAS1转录水平在24-48 h达到峰值，处理组齐墩果酸含量从0.2-0.3 mg/g（未处理）上升至最高1.2 mg/g（14 d），约提高6倍。
研究结论
GsAS1是麻花艽中一个单功能的β-香树脂合酶基因，其表达受MeJA显著上调，并与齐墩果酸积累呈正相关，表明GsAS1是齐墩果酸生物合成的一个关键酶，可作为代谢工程改造的靶点。