Short-Chain Prenyl Diphosphate Synthase That Condenses Isopentenyl Diphosphate with Dimethylallyl Diphosphate in ispA Null Escherichia coli Strain Lacking Farnesyl Diphosphate Synthase
- 作者
- Ken Saito, Shingo Fujisaki, Tokuzo Nishino
- 单位
- 日本东北大学工学部生物工程系；日本东邦大学理学部生物分子科学系
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2007）
- DOI
- 10.1263/jbb.103.575
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在ispA缺失的大肠杆菌突变株中，鉴定并表征能够替代法尼基二磷酸合酶催化IPP与DMAPP缩合反应的酶。
研究策略
通过DEAE-Toyopearl柱层析从ispA缺失突变株SF7的无细胞匀浆中分离各种异戊烯基二磷酸合酶，对分离出的N1酶进行进一步纯化，并通过产物分析、底物特异性、镁离子依赖及去垢剂影响等实验表征其酶学性质。
核心内容
在ispA缺失的大肠杆菌突变株SF7中，法尼基二磷酸合酶缺失导致IPP与DMAPP的缩合活性仅为野生型W3110的5%。研究通过DEAE-Toyopearl柱层析从SF7无细胞匀浆中分离异戊烯基二磷酸合酶，在十一异戊烯基二磷酸合酶和八异戊烯基二磷酸合酶峰之间发现一个小峰N，再次层析分离出N1、N2和N3三个组分。酶学表征显示N1是一种新型短链异戊烯基二磷酸合酶，以FPP为最有效底物（相对活性100%），GPP和DMAPP分别为50%和11%，可催化IPP与DMAPP生成FPP和GGPP，催化IPP与GPP生成FPP，催化IPP与FPP生成GGPP。酶活性依赖镁离子，最适浓度为1 mM；添加0.05% Triton X-100使活性提高1.5倍。纯化后比活为4.02 pmol/min/mg，纯化倍数13.1倍，分子量约65 kDa。N1是SF7中催化IPP与DMAPP缩合生成FPP的主要酶，可部分补偿FPP合酶缺失；N2和N3为八异戊烯基二磷酸合酶不可互变的异构体。这些发现揭示了大肠杆菌异戊二烯代谢的酶学可塑性。
创新点
首次发现并纯化了一种新的短链异戊烯基二磷酸合酶N1，该酶可同时生成FPP和GGPP；首次发现八异戊烯基二磷酸合酶存在N2和N3两个不可互变的异构体。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli SF7 (ispA null mutant) | 类异戊二烯生物合成路径（IPP/DMAPP缩合） | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 该基因缺失，导致菌株生长缓慢，残存活性为野生型5% |
| Escherichia coli W3110 | 类异戊二烯生物合成路径（IPP/DMAPP缩合） | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 野生型菌株，对照实验 |
| Escherichia coli SF7 (ispA null mutant) | 类异戊二烯生物合成路径 | 未知 | 短链异戊烯基二磷酸合酶 N1 | 催化 | 新发现的酶，催化IPP与DMAPP生成FPP和GGPP；纯化13.1倍，分子量65±8kDa |
| Escherichia coli SF7 (ispA null mutant) | 泛醌侧链生物合成 | ispB | 八异戊烯基二磷酸合酶 | 催化 | 对应DEAE层析峰B，N2和N3为其异构体 |
| Escherichia coli SF7 (ispA null mutant) | 细胞壁载体脂质合成 | rth (uppS) | 十一异戊烯基二磷酸合酶 | 催化 | 对应DEAE层析峰A，是必需基因 |
关键发现
- 在ispA缺失突变株SF7中，IPP与DMAPP的缩合活性仅为野生型W3110的5%
- DEAE层析在十一异戊烯基二磷酸合酶（峰A）和八异戊烯基二磷酸合酶（峰B）之间出现小峰N，再次层析分离出N1、N2和N3三个峰
- N1酶以FPP为最有效底物（活性为100%），GPP和DMAPP的相对活性分别为50%和11%
- N1酶催化IPP与DMAPP生成FPP和GGPP，催化IPP与GPP生成FPP，催化IPP与FPP生成GGPP
- 酶活性依赖镁离子，最适浓度为1 mM
- 添加0.05% Triton X-100使活性提高1.5倍，0.1%以上则抑制
- 纯化后比活为4.02 pmol/min/mg，纯化倍数13.1倍，回收率13.0%
- 分子量约为65±8 kDa。
研究结论
在大肠杆菌ispA缺失突变株中，新发现的短链异戊烯基二磷酸合酶N1是催化IPP与DMAPP缩合生成FPP的主要酶，可部分补偿FPP合酶缺失；N2和N3为八异戊烯基二磷酸合酶的异构体，且两者不可互变。这些酶的鉴定为理解大肠杆菌异戊二烯代谢的可塑性提供新见解。