Mono and Diterpene Production in Escherichia coli
- 作者
- K. Kinkead Reiling, Yasuo Yoshikuni, Vincent J.J. Martin, Jack Newman, Jörg Bohlmann, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, The University of California Berkeley; UCSF/UCB Joint Graduate Program in Bioengineering, The University of California Berkeley; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Biotechnology Laboratory, Department of Botany and Department of Forest Sciences, University of British Columbia
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2004）
- DOI
- 10.1002/bit.20128
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中单萜和二萜前体香叶基二磷酸(GPP)和香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的胞内水平不足，限制了单萜和二萜类化合物的微生物生产。
研究策略
构建合成操纵子共表达DXP合酶(dxs)、来自雨生红球藻的IPP异构酶(IPIHp)以及野生型或突变型大肠杆菌FPP合酶(IspA)以增强GPP/GGPP前体供应，并与萜烯环化酶共表达实现单萜和二萜的体内合成。
核心内容
该研究通过在大肠杆菌中工程化萜类前体供应途径，实现了多种单萜和二萜的体内合成。研究者构建了共表达DXP合酶（dxs）、来自雨生红球藻的IPP异构酶（IPIHp）以及野生型或突变型大肠杆菌FPP合酶（IspA）的合成操纵子，并通过定点突变将IspA改造为GGPP合酶（Tyr80Asp）和GPP合酶（Ser81Phe），以增强GPP/GGPP前体供给。以番茄红素为报告系统，最优操纵子使产量达1.21 mg/L/OD600。体外酶活显示IspA突变体的GGPP和GPP产物分别占80%和90%以上。与不同萜烯环化酶共表达后，casbene最高产量约30 μg/OD600/L，3-carene约3 μg/L/OD600，并检测到kaur-16-ene、kaur-15-ene、α-pinene、myrcene、sabinene等多种产物。该工作建立了模块化的前体合成平台，证明大肠杆菌可作为单萜和二萜异源生产的可行宿主，为萜类药物开发提供了基础。
创新点
通过定点突变将大肠杆菌内源FPP合酶IspA改造为GGPP合酶(Tyr80Asp)和GPP合酶(Ser81Phe)；构建模块化前体合成操纵子；首次在大肠杆菌中实现casbene、kaur-15-ene等多种二萜以及α-pinene、myrcene、sabinene、3-carene等多种单萜的体内生产。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | DXP途径（萜类前体合成） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 过表达以增强IPP/DMAPP前体通量 |
| Escherichia coli | 萜类前体合成 | IPIHp | IPP异构酶（来自雨生红球藻） | 催化 | 催化IPP与DMAPP相互转化 |
| Escherichia coli | 萜类前体合成 | ispA (wild-type) | FPP合酶（IspA） | 催化 | 野生型，主要产生法尼基二磷酸(FPP) |
| Escherichia coli | 萜类前体合成 | ispA (Y80D) | IspA(Tyr80Asp)突变体 | 催化 | 突变后产物特异性转变为GGPP合酶 |
| Escherichia coli | 萜类前体合成 | ispA (S81F) | IspA(Ser81Phe)突变体 | 催化 | 突变后产物特异性转变为GPP合酶 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成（报告系统） | crtE | GGPP合酶（来自成团泛菌） | 催化 | pAC-LYC质粒中组成型表达，用于检测GGPP |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成（报告系统） | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | pAC-LYC/pACYC-IB质粒中表达 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成（报告系统） | crtI | 番茄红素合酶（脱氢酶） | 催化 | pAC-LYC/pACYC-IB质粒中表达，催化生成番茄红素 |
| Escherichia coli | 二萜合成 | casbene cyclase (来自蓖麻) | Casbene环化酶 | 催化 | 以GGPP为底物生成casbene |
| Escherichia coli | 二萜合成 | ent-kaurene cyclase (来自Phaeosphaeria sp. L487) | ent-kaurene环化酶 | 催化 | 以GGPP为底物生成kaur-16-ene和kaur-15-ene |
| Escherichia coli | 单萜合成 | 3-carene cyclase (来自欧洲云杉) | 3-蒈烯环化酶 | 催化 | 以GPP为底物，主要产物3-carene，并产生α-pinene、myrcene、sabinene等多种副产物 |
关键发现
- SOE4(FPP)操纵子使番茄红素产量比野生型提高6倍；pBBRSOE5与pACYC-IB共转化菌株最高番茄红素产量为1.08±0.02 mg/L/OD600，pBBRSOE4与pAC-LYC共转化为1.21±0.03 mg/L；体外酶活显示IspA(Tyr80Asp)产物中GGPP占>80%，IspA(Ser81Phe)产物中GPP占>90%；casbene环化酶在pBBRSOE5/pTrcCas菌株中最高产量约30 μg/OD600/L，生产速率约6 μg/OD600/L/h；ent-kaurene环化酶产生kaur-16-ene和kaur-15-ene，相对丰度分别为100%和6.7%；3-carene环化酶在pBBRSOE6/pTrcCar菌株中3-carene最高产量约3 μg/L/OD600，生产速率0.42 μg/OD600/L/h；体外3-carene环化酶产物分布为α-pinene
- 9%、myrcene
- 6%、sabinene
- 9%、3-carene 100%、γ-terpinene
- 1%、limonene
- 8%、β-phellandrene
- 9%、α-terpinene
- 0%、terpinolene
- 5%。
研究结论
通过工程化GPP/GGPP前体合成操纵子并共表达萜烯环化酶，成功在大肠杆菌中实现多种单萜和二萜的体内生产，为萜类化合物的微生物异源合成提供了前体平台，有望用于萜类药物的开发与生产。