Multienzyme Mevalonate Pathway Bioreactor
- 作者
- Autumn Sutherland, Victor W. Rodwell
- 单位
- Department of Biochemistry, Purdue University, 175 South University Street, West Lafayette, Indiana 47907-2063
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2004）
- DOI
- 10.1002/bit.20157
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种快速高通量的基于生物反应器的测定方法，以同时评估针对甲羟戊酸途径多个酶的潜在抑制剂，用于开发针对多重耐药细菌的新抗生素。
研究策略
采用粪肠球菌甲羟戊酸途径的前三个酶（乙酰乙酰CoA硫解酶/HMG-CoA还原酶融合蛋白、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶），通过两种固定化方式（中空纤维反应器和基于Ni-NTA亲和吸附的填充床反应器）构建连续流多酶生物反应器，将乙酰-CoA转化为甲羟戊酸，并通过监测NADPH消耗评估反应器性能。
研究路线图
核心内容
本研究构建了基于粪肠球菌甲羟戊酸途径前三个酶的多酶连续流生物反应器，旨在高通量筛选针对多重耐药细菌的抗生素抑制剂。作者将乙酰乙酰CoA硫解酶/HMG-CoA还原酶融合蛋白、HMG-CoA合酶及非融合HMG-CoA还原酶通过两种固定化方式——中空纤维反应器和基于Ni-NTA亲和吸附的填充柱反应器——组装为连续催化系统，将乙酰-CoA转化为甲羟戊酸，并以NADPH消耗监测反应效率。结果显示，Ni亲和柱三酶反应器在0.25 ml/min流速下实现75%的NADPH转化率，对应乙酰-CoA转化率为47%，显著优于中空纤维反应器的20%；单酶反应器对底物转化率高达95%。融合蛋白中的HMG-CoA还原酶活性被确认为途径限速步骤。固定化酶在4°C储存两周后仍保留超过50%活性。该Ni亲和柱系统可同时固定多个组氨酸标签酶并保持活性，为代谢途径抑制剂筛选及多酶催化研究提供了高效平台。
创新点
['首次利用组氨酸标签酶通过Ni亲和吸附同时固定化多个酶并保持其催化活性', '构建了模拟体内多酶途径的连续流生物反应器，可用于抗生素候选抑制剂的筛选']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaE | 双功能乙酰乙酰CoA硫解酶/HMG-CoA还原酶 | 催化 | 催化乙酰乙酰CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶反应，即途径的第一步和第三步 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 催化HMG-CoA合酶反应，即途径的第二步 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaE（片段，编码非融合HMG-CoA还原酶） | 非融合HMG-CoA还原酶（残基400-823） | 催化 | 催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸，补充融合蛋白的还原酶活性 |
关键发现
- ['中空纤维反应器在0.25 ml/min流速下达到最大产物生成
- 当HMG-CoA合酶与融合蛋白等摩尔（3.75 nmol）时NADPH转化率为10%，添加9.0 nmol非融合HMG-CoA还原酶后升至16%，表明融合蛋白的HMG-CoA还原酶活性是限速步骤', 'Ni亲和柱单酶反应器（200 nmol HMG-CoA还原酶）对0.5 mM HMG-CoA和0.25 mM NADPH的转化率为95%', '三酶Ni亲和柱反应器（22.5 nmol HMG-CoA合酶、65 nmol融合蛋白、90 nmol非融合HMG-CoA还原酶）在0.25 ml/min流速下最大NADPH转化率为75%，对应乙酰-CoA转化率为47%', 'NiNTA柱在4°C反应缓冲液（不含乙酰-CoA）中储存2周后保留超过50%初始活性
- 随后在室温储存5天，活性降至初始值的4%', '在可比较条件下，中空纤维反应器仅达到20%转化率']
研究结论
Ni++亲和柱生物反应器优于中空纤维反应器，可同时固定多个组氨酸标签酶并保持活性，适用于筛选针对甲羟戊酸途径的潜在抗生素抑制剂，也可拓展至极端环境酶的应用及代谢流研究。