Developing High Cell Density Fed-Batch Cultivation Strategies for Heterologous Protein Production in Pichia pastoris Using the Nitrogen Source-Regulated FLD1 Promoter
- 作者
- David Resina, Oriol Cos, Pau Ferrer, Francisco Valero
- 单位
- Departament d'Enginyeria Quimica, Escola Tecnica Superior d'Enginyeria, Universitat Autonoma de Barcelona, 08193- Bellaterra, Spain
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2005）
- DOI
- 10.1002/bit.20545
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发基于FLD1启动子（PFLD）的毕赤酵母无甲醇高细胞密度补料分批培养策略，用于异源蛋白（Rhizopus oryzae脂肪酶）的生产，并探究不同比生长速率对产物合成与分泌的影响。
研究策略
采用预编程指数补料策略，以山梨醇和甲胺作为碳源和氮源进行诱导，通过设定不同恒定比生长速率（0.005/h、0.01/h）以及恒定残留山梨醇浓度8 g/L（近μmax）进行三种补料分批发酵，比较生产效率。
核心内容
该研究开发了基于FLD1启动子驱动的毕赤酵母无甲醇高细胞密度补料分批培养策略，用于异源蛋白Rhizopus oryzae脂肪酶的生产。采用预编程指数补料策略，以山梨醇和甲胺分别作为碳源和氮源进行诱导，通过设定不同恒定比生长速率（0.005/h、0.01/h）以及恒定残留山梨醇浓度8 g/L（近μmax）进行三种补料分批发酵比较。结果显示，在近μmax条件下细胞外脂肪酶活性最高达385 AU/mL，分别是低生长速率组的2.2倍和9.2倍；生产率达4379 AU/(L·h)，比0.01/h组高1.9倍，比0.005/h组高7.6倍。低生长速率下比生产速率指数下降至接近零，而高生长速率下可稳定维持在150 AU/(g X·h)左右。与经典PAOX系统相比，该策略生产率高出1.5至1.9倍。研究表明PFLD启动子结合山梨醇和甲胺可有效实现无甲醇高密度异源蛋白生产，且高比生长速率更有利于产物合成与分泌。
创新点
首次开发了基于PFLD启动子的无甲醇补料分批高细胞密度培养策略；使用山梨醇+甲胺替代甲醇+铵，避免甲醇挥发和氧需求高的问题；系统比较了不同生长速率下PFLD系统的生产性能，并证明高生长速率更有利于ROL分泌。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33 | 甲醇/甲胺代谢途径 | FLD1 | 甲醛脱氢酶 (Fld1p) | 催化 | FLD1基因编码甲醛脱氢酶，其启动子受甲胺或甲醇诱导，用于驱动异源蛋白表达 |
| Pichia pastoris X-33 | 异源蛋白表达通路 | ROL (Rhizopus oryzae lipase gene) | Rhizopus oryzae脂肪酶 (ROL) | 催化 | 目标异源蛋白，由PFLD启动子控制表达，催化脂质水解 |
| Pichia pastoris X-33 | PFLD调控 | PFLD (FLD1启动子) | — | 调控 | 氮源（甲胺）调节的启动子，用于调控ROL基因转录 |
关键发现
在恒定残留山梨醇8 g/L（平均μ约0.02/h，近μmax）条件下，细胞外脂肪酶活性最高达385 AU/mL，分别是μ=0.01/h（177 AU/mL）的2.2倍和μ=0.005/h（42 AU/mL）的9.2倍。Y_P/X为7634 AU/g X，比μ=0.01/h（5932 AU/g X）高1.3倍，比μ=0.005/h（1658 AU/g X）高4.6倍。生产率为4379 AU/(L·h)，比μ=0.01/h（2254）高1.9倍，比μ=0.005/h（579）高7.6倍。比生产率为87 AU/(g X·h)，比μ=0.01/h（76）高1.1倍，比μ=0.005/h（23）高3.8倍。最大q_p在近μmax时为388 AU/(g X·h)，分别为0.01/h（206）的1.9倍和0.005/h（88）的4.4倍。与PAOX系统相比，PFLD近μmax培养的生产率比PAOX Mut+（2246 AU/(L·h)）高1.9倍，比MutS（3000 AU/(L·h)）高1.5倍。低生长速率下q_p指数下降至接近零，而高生长速率下q_p在诱导后约50 h稳定在150 AU/(g X·h)左右。
研究结论
PFLD系统结合山梨醇和甲胺可作为毕赤酵母无甲醇高细胞密度生产异源蛋白的有效工具，在高比生长速率（近μmax）下其生产率和比生产率优于经典PAOX系统。但产物合成与分泌的调控机制仍需进一步研究。