高级醇 · 代谢工程文献库

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Shikimic Acid Production by a Modified Strain of E. coli (W3110.shik1) Under Phosphate-Limited and Carbon-Limited Conditions

作者
Louise Johansson, Anna Lindskog, Gustav Silfversparre, Christian Cimander, Kristian Fog Nielsen, Gunnar Liden
单位
Department of Chemical Engineering, Lund University; Novozymes Biopharma AB; Center for Microbial Biotechnology, Technical University of Denmark
杂志
Biotechnology and Bioengineering（2005）
DOI
10.1002/bit.20546
所属领域
代谢工程
关键词
Escherichia colicarbon limitationcell physiologychemostatphosphate limitationshikimic acid
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解决的核心问题

如何通过磷酸盐限制培养提高工程大肠杆菌莽草酸产量并降低副产物，同时评估细胞生理变化和工艺可行性

研究策略

构建仅敲除aroL的莽草酸生产菌株W3110.shik1，利用恒化培养分别在碳限制和磷酸盐限制条件下进行稳态培养，比较产物产量、副产物谱、碳平衡、细胞裂解及呼吸参数

研究路线图

100%
研究问题：磷酸盐限制能否提高莽草酸产量
策略：构建ΔaroL菌株W3110.shik1
方法：恒化培养双条件稳态比较
关键改造：敲除aroL保留aroK+FBR突变
结果1：莽草酸产量提高2.5倍
结果2：副产物DHS显著下降
结果3：细胞裂解率高达30%
结果4：乙酸产量增加至0.026
结论：磷酸盐限制可行但需优化防裂解
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核心内容

该研究构建了仅敲除莽草酸激酶II基因aroL的E. coli W3110.shik1菌株，通过恒化培养系统比较磷酸盐限制和碳限制两种条件下的莽草酸生产性能。磷酸盐限制下莽草酸产量达0.059 c-mol/c-mol葡萄糖，显著高于碳限制的0.024 c-mol/c-mol，同时副产物3-脱氢莽草酸产量从0.076降至0.022 c-mol/c-mol，碳限制下还检出3-脱氢奎尼酸、奎宁酸和没食子酸等副产物。但磷酸盐限制伴随明显的细胞裂解现象，裂解率最高达30%，且乙酸产量从0.004升至0.026 c-mol/c-mol。菌株最大比生长速率在两种条件下均显著低于野生型W3110。结果表明磷酸盐限制策略可有效提升莽草酸产量并简化副产物谱，但细胞裂解和乙酸积累可能增加下游处理成本，需要在工艺层面加以优化以发挥该策略的潜力。

创新点

采用仅敲除aroL（保留aroK）的策略，避免添加下游芳香族氨基酸和维生素；系统比较磷酸盐限制与碳限制对莽草酸生产及副产物的影响，发现磷酸盐限制显著提高产量并减少副产物，同时首次报道该菌株在磷酸盐限制下的显著细胞裂解现象

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli W3110.shik1 莽草酸途径/芳香族氨基酸合成途径 aroL 莽草酸激酶II 催化 被敲除（ΔaroL），减少莽草酸磷酸化
Escherichia coli W3110.shik1 莽草酸途径 aroK 莽草酸激酶I 催化 保留，允许少量碳流通过莽草酸
Escherichia coli W3110.shik1 莽草酸途径 aroG^FBR DAHP合酶（3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶） 催化 反馈抑制抗性突变，增强碳流进入莽草酸途径
Escherichia coli W3110.shik1 莽草酸途径 aroF^FBR DAHP合酶 催化 质粒pSGs26携带，反馈抑制抗性
Escherichia coli W3110.shik1 芳香族氨基酸合成途径 trpE^FBR 邻氨基苯甲酸合酶组分I 催化 反馈抑制抗性，影响色氨酸合成
Escherichia coli W3110.shik1 色氨酸降解途径 tnaA 色氨酸酶 催化 参与色氨酸降解，可能影响细胞内色氨酸水平
Escherichia coli W3110.shik1 莽草酸途径 aroE 莽草酸脱氢酶 催化 受莽草酸反馈抑制，未过表达导致DHS积累
Escherichia coli W3110.shik1 莽草酸转运 shiA 莽草酸/质子同向转运体 转运 碳限制条件下可能介导莽草酸摄取，参与氢芳香族平衡

关键发现

  1. 磷酸盐限制下莽草酸产量为0.059±0.012 c-mol/c-mol葡萄糖，高于碳限制的0.024±0.005
  2. 副产物3-脱氢莽草酸(DHS)产量从0.076±0.028降至0.022±0.001 c-mol/c-mol
  3. 碳限制下还检出3-脱氢奎尼酸(DHQ)0.021±0.021、奎宁酸0.012±0.005、没食子酸0.002±0.001
  4. W3110.shik1最大比生长速率在碳限制和磷酸盐限制下分别为0.33±0.04和0.39±0.04 h-1，明显低于W3110的0.58±0.03和0.71±0.06 h-1
  5. 细胞裂解率最高达30%，磷酸盐限制下细胞裂解增加，W3110.shik1裂解程度高于W3110
  6. 磷酸盐限制下乙酸产量增加（W3110.shik1从0.004升至0.026±0.010 c-mol/c-mol）

研究结论

磷酸盐限制培养W3110.shik1可提高莽草酸产量并降低莽草酸途径副产物，但伴随细胞裂解和乙酸产量增加，可能增加下游处理成本；总体而言磷酸盐限制有利于莽草酸生产，但需优化工艺以减轻裂解带来的不利影响