The Expression of a Pichia stipitis Xylose Reductase Mutant With Higher \(K_{\mathrm{M}}\) for NADPH Increases Ethanol Production From Xylose in Recombinant Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Marie Jeppsson, Oskar Bengtsson, Katja Franke, Hung Lee, Bärbel Hahn-Hägerdal, Marie F. Gorwa-Grauslund
- 单位
- Department of Applied Microbiology, Lund University; Department of Environmental Biology, University of Guelph
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2005）
- DOI
- 10.1002/bit.20737
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组酿酒酵母发酵木糖产乙醇时，木糖还原酶（XR）与木糖醇脱氢酶（XDH）辅因子偏好不一致导致辅因子不平衡，产生大量副产物木糖醇，乙醇产率远低于理论值。
研究策略
将P. stipitis的XYL1基因进行K270M点突变（提高对NADPH的Km、降低对NADPH的亲和力），以单拷贝或双拷贝形式整合至含XYL2与过表达XKS1的重组酿酒酵母中，通过批量和连续厌氧发酵比较突变型与野生型XR对木糖发酵产物分布的影响。
核心内容
本研究针对重组酿酒酵母发酵木糖产乙醇时，因木糖还原酶（XR）偏好NADPH而木糖醇脱氢酶偏好NADH所导致的辅因子不平衡及木糖醇副产物累积问题，将P. stipitis的XYL1基因进行K270M点突变以降低其对NADPH的亲和力，并分别以单拷贝和双拷贝形式整合至含XYL2及过表达XKS1的酿酒酵母菌株中，通过批量及连续厌氧发酵比较突变型与野生型XR的发酵表现。酶动力学测定显示K270M突变使XR对NADPH的Km提高17倍至185 μM，对木糖的Km提高14倍，而对NADH的Km不变。在连续厌氧培养中，双拷贝突变菌株TMB3271乙醇产率达0.40 g/g总底物，木糖醇产率降至0.44 g/g木糖，明显优于野生型对照的0.36 g/g乙醇和0.58 g/g木糖醇。代谢通量分析证实突变型菌株XR反应中NADH利用率大幅提升至86%–100%，同时氧化磷酸戊糖途径通量显著下降。该策略通过改变辅因子偏好有效减少木糖醇生成、提高乙醇产率，为酿酒酵母木糖发酵性能改造提供了可行方案。
创新点
首次在重组酿酒酵母中利用点突变型XR（K270M）将辅因子利用从NADPH转向NADH，从而减少木糖醇生成并提高乙醇产率；结合代谢通量分析证明突变型XR在体内更多利用NADH。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7A及其衍生菌株(TMB3001, TMB3260, TMB3270, TMB3271) | 木糖还原-木糖醇脱氢-木酮糖激酶途径 | XYL1 (K270M) | 木糖还原酶（XR）突变体K270M | 催化 | 对NADPH的Km提高17倍，对木糖的Km提高14倍，对NADH的Km不变；在体内更多利用NADH |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7A衍生菌株 | 木糖还原-木糖醇脱氢-木酮糖激酶途径 | XYL1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 来自Pichia stipitis的野生型XR，利用NADPH和NADH |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7A衍生菌株 | 木糖还原-木糖醇脱氢-木酮糖激酶途径 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 来自Pichia stipitis，严格依赖NAD+ |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7A衍生菌株 | 木糖还原-木糖醇脱氢-木酮糖激酶途径 | XKS1 | 木酮糖激酶（XK） | 催化 | 内源基因，在研究中过表达 |
关键发现
- K270M突变使XR对NADPH的Km提高17倍（185 μM vs 11 μM），对木糖的Km提高14倍（625 mM vs 44 mM），对NADH的Km不变。在厌氧连续培养（10 g/L葡萄糖+10 g/L木糖，稀释率0.06/h）中，过表达突变型XR的菌株TMB3271乙醇产率达0.40 g/g总底物，木糖消耗速率为0.16 g/g生物量/h，木糖醇产率为0.44 g/g木糖
- 对照野生型高表达菌株TMB3260乙醇产率0.36 g/g、木糖醇产率0.58 g/g木糖。单拷贝突变型TMB3270乙醇产率0.40 g/g，木糖消耗速率仅0.05 g/g/h，但木糖醇产率降至0.31 g/g木糖。批量发酵（50 g/L木糖、静息细胞）中，TMB3270乙醇产率0.36 g/g（对照TMB3001为0.31），木糖醇产率0.17 g/g（对照为0.29）
- TMB3271木糖醇产率降至0.09 g/g（对照TMB3260为0.13）。通量分析表明，突变型菌株TMB3270和TMB3271的XR反应分别使用100%和86%的NADH（对照TMB3001和TMB3260分别为47%和36%NADH），氧化磷酸戊糖途径通量分别降至7%和12%（对照为15%和22%）。
研究结论
表达对NADPH亲和力降低的K270M突变型木糖还原酶可有效将辅因子利用从NADPH转向NADH，降低木糖醇产率、提高乙醇产率，是改造酿酒酵母木糖发酵性能的有效策略。