Metabolic Flux Analysis for Recombinant Protein Production by Pichia pastoris Using Dual Carbon Sources: Effects of Methanol Feeding Rate
- 作者
- Eda Celik, Pinar Calik, Stephen G. Oliver
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Industrial Biotechnology and Metabolic Engineering Laboratory, Middle East Technical University, 06531 Ankara, Turkey; Department of Biochemistry, University of Cambridge, Cambridge, UK
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2010）
- DOI
- 10.1002/bit.22543
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究双碳源（甲醇/山梨醇）和不同甲醇补料速率对毕赤酵母（Pichia pastoris）生产重组人促红细胞生成素（rHuEPO）过程中胞内中心碳代谢通量分布的影响，以深入理解代谢调控机制并识别重组蛋白生产的潜在代谢瓶颈。
研究策略
构建包含102个代谢物和141个反应的毕赤酵母胞内化学计量反应网络模型，基于伪稳态假设采用质量通量平衡分析（MFA），结合四种补料分批发酵实验（M-0.03、MS-0.02、MS-0.03、MS-0.04）的胞外浓度数据，计算各时期胞内代谢通量分布。
核心内容
该研究通过构建包含102个代谢物和141个反应的毕赤酵母化学计量网络模型，基于伪稳态假设的质量通量平衡分析，系统考察了甲醇/山梨醇双碳源及不同甲醇补料速率对重组人促红细胞生成素（rHuEPO）生产过程中胞内中心碳代谢通量分布的影响。四种补料分批发酵实验显示，在MS-0.02条件下几乎全部甲醛（>99%）进入同化途径，甲醇补料未超过细胞需求；而甲醇补料过量时，代谢向异化途径偏移。山梨醇共底物使rHuEPO合成通量在相同甲醇速率下提高4.4倍；MS-0.02条件下Period II的rHuEPO合成通量最高，为0.0068 μmol/g DW/h，是甲醇单碳源条件的2倍，且该条件下糖酵解、糖异生和PPP通路持续稳定运行。值得注意的是，MS-0.02条件下酪氨酸合成通路完全缺失，构成代谢瓶颈，需依赖外源添加。研究揭示山梨醇共底物降低甲醇和氧气需求、减轻甲醇毒性的代谢基础，并确定μ0=0.02 h⁻¹、山梨醇初始浓度50 g/L为最有利生产条件，为毕赤酵母重组蛋白生产的代谢工程改造提供了明确靶点。
创新点
首次对Mut+型毕赤酵母在甲醇/山梨醇双碳源补料分批过程中的代谢通量进行系统分析；揭示了山梨醇共底物降低甲醇和氧气需求、减轻甲醇毒性的代谢基础；发现了MS-0.02条件下酪氨酸合成缺失这一代谢瓶颈。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris (Mut+) 菌株E17 | 甲醇代谢 | AOX1 | 醇氧化酶（alcohol oxidase） | 催化 | 甲醇诱导型启动子AOX1控制EPO表达，其编码的醇氧化酶催化甲醇氧化为甲醛（R1） |
| Pichia pastoris (Mut+) 菌株E17 | 乳酸代谢 | ldhA（推定） | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 涉及R32/R33反应，催化丙酮酸与乳酸互变，蛋白ID XP_002491260.1和XP_002492901.1 |
关键发现
- 在MS-0.02条件下，几乎全部甲醛（>99%）进入同化途径，甲醇补料未超过细胞需求
- 而在MS-0.03和MS-0.04条件下，甲醇补料过量，代谢向异化途径偏移。比较相同甲醇补料速率的M-0.03与MS-0.03条件，山梨醇添加使rHuEPO合成通量提高4.4倍（Period I）。MS-0.02条件下Period II的rHuEPO合成通量最高，为0.0068 μmol/g DW/h，是M-0.03条件的2倍。MS-0.04条件下Period I的rHuEPO合成通量达0.0103 μmol/g DW/h，但维持能需求也最高（R141=16.40 mmol/g DW/h）。M-0.03条件下甲醇摄取通量在三个时期分别为3.345、3.787、3.998 mmol/g DW/h。MS-0.02条件下糖酵解、糖异生和PPP通路在所有时期均不间断运行
- MS-0.04条件下PPP和TCA循环受扰动最大。在MS-0.02条件下，酪氨酸在整个过程中未合成，需依赖外源添加或通过异化反应R84补充。
研究结论
山梨醇作为共底物可降低甲醇和氧气需求，减轻甲醇毒性压力；在μ0=0.02 h^-1、山梨醇初始浓度50 g/L的MS-0.02条件下，代谢通量分布最稳定，rHuEPO合成效率最高，是最有利的生产条件；添加酪氨酸可消除该条件下的代谢瓶颈。