Production of Biocommodities and Bioelectricity by Cell-Free Synthetic Enzymatic Pathway Biotransformations: Challenges and Opportunities
- 作者
- Y.-H. Percival Zhang
- 单位
- Biological Systems Engineering Department, Virginia Polytechnic Institute and State University; Institute for Critical Technology and Applied Science (ICTAS), Virginia Polytechnic Institute and State University; DOE Bioenergy Science Center
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2010）
- DOI
- 10.1002/bit.22630
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解决无细胞合成酶途径生产低值生物商品和生物电的经济性问题，特别是酶和辅酶的不稳定与高成本障碍。
研究策略
提出无细胞合成途径生物转化（SyPaB）的设计原则，包括ATP和NAD(P)H平衡、酶选择与工程、低成本酶生产与固定化、辅酶循环及仿生辅酶替代，并通过实验实例和成本模型论证其可行性。
核心内容
该研究系统探讨了无细胞合成酶途径生物转化（SyPaB）生产低值生物商品与生物电的可行性，针对酶和辅酶不稳定、成本高昂的核心瓶颈，提出了包括ATP与NAD(P)H平衡、热稳定酶筛选与工程、酶固定化、辅酶循环及仿生辅酶替代在内的设计原则。实验上，以纤维五糖为底物的无细胞产氢途径获得11.2 mol H₂/每摩尔葡萄糖残基，达到理论产率的93.1%；无细胞乙醇发酵系统在ATPase辅助下，8小时内将180 g/L葡萄糖完全转化为90 g/L乙醇，产率99%。此外，固定化11种酶模拟柠檬酸循环的生物燃料电池，其功率密度较单酶体系提高8.71倍。来自嗜热菌的6-磷酸葡糖酸脱氢酶和磷酸葡糖变位酶分别实现了420,000和415,000的重量基准总转换数（TTNw）。成本模型显示，优化后SyPaB的稳定酶成本可降至微生物发酵的0.1%，表明通过模块化稳定酶体系与高效辅酶再生，无细胞合成途径在产率和成本上均可超越传统微生物发酵，为生物制造提供了一条可行替代路线。
创新点
提出基于重量基准总转换数（TTNw）的成本比较框架；设计并验证接近理论产率的无细胞产氢途径；展示无细胞乙醇、丁醇及生物电生产的潜力；提倡利用热稳定酶和低成本仿生辅酶类似物显著降低成本。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 无细胞酶体系 | 产氢合成途径（葡聚糖/纤维寡糖 → H2 + CO2） | — | 葡萄糖磷酸化酶（GNP）、磷酸葡糖变位酶（PGM）、6-磷酸葡糖脱氢酶（G6PDH）、6-磷酸葡糖酸脱氢酶（6PGDH）、磷酸核糖异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶、转醛醇酶、磷酸丙糖异构酶、醛缩酶、果糖-1,6-二磷酸酶、磷酸葡糖异构酶、氢化酶 | 催化 | 从纤维五糖和水自发产生H2，实验获得11.2 mol H2/mol葡萄糖残基（理论产率93.1%），最大产氢速率3.92 mmol/L/h。 |
| 无细胞酵母糖酵解系统 | 糖酵解途径（葡萄糖 → 乙醇） | — | 酵母糖酵解酶系（包括己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等）及ATPase | 催化 | 在ATPase补充下完全转化180 g/L葡萄糖为90 g/L乙醇，产率99%，反应时间8小时。 |
| 无细胞系统 | 丁醇合成途径（改造的ABE发酵途径） | — | 丁醇合成相关酶（基于梭菌途径，未具体列出） | 催化 | 需要ATPase、磷酸酶或砷酸盐维持ATP平衡，可避免产物抑制，提高产率。 |
| 酶修饰碳电极 | 柠檬酸循环模拟途径（乙醇 → CO2 + 电） | — | 6种脱氢酶（包括乙醇脱氢酶等）和5种非能量产生酶 | 催化 | 固定化于电极，用聚亚甲基绿作介体，功率密度较单酶乙醇/空气燃料电池提高8.71倍。 |
| 大肠杆菌Escherichia coli（酶生产宿主） | 重组酶表达 | — | Thermotoga maritima 6-磷酸葡糖酸脱氢酶（Tm 6PGDH） | 催化 | 在E. coli中过表达，占细胞总蛋白30%以上，Vmax=320 μmol/mg/s，80°C下T1/2=140 h，TTNw=420,000。 |
| 大肠杆菌Escherichia coli（酶生产宿主） | 重组酶表达 | — | Clostridium thermocellum 磷酸葡糖变位酶（Ct PGM） | 催化 | Vmax=880 μmol/mg/s，60°C下半衰期72 h，TTNw=415,000。 |
关键发现
- 产氢实验以纤维五糖为底物，获得11.2 mol H2/每摩尔葡萄糖残基（理论产率的93.1%）和5.64 mol CO2（理论产率的94%），最大产氢速率3.92 mmol/L/h
- 无细胞乙醇发酵系统在ATPase辅助下，8小时内将180 g/L葡萄糖完全转化为90 g/L乙醇，产率99%
- 酶生物燃料电池通过固定化11种酶模拟柠檬酸循环，功率密度较单酶乙醇/空气燃料电池提高8.71倍
- Thermotoga maritima 6-磷酸葡糖酸脱氢酶（Tm 6PGDH）的TTNw达420,000，Clostridium thermocellum磷酸葡糖变位酶（Ct PGM）的TTNw为415,000
- 成本分析表明SyPaB的稳定酶成本仅为微生物成本的56%（R=1.8），优化后R可达1000（酶成本低至0.1%）。
研究结论
尽管存在酶和辅酶稳定性及成本挑战，但通过开发稳定酶标准化模块、高效辅酶循环和低成本的仿生辅酶类似物，无细胞SyPaB在生产生物商品和生物电方面可比微生物发酵具有更低的生产成本和更高产率，是可行的替代方案。