Mutants of the Pentose-Fermenting Yeast Pichia stipitis With Improved Tolerance to Inhibitors in Hardwood Spent Sulfite Liquor
- 作者
- Paramjit K. Bajwa, Tasnina Shireen, Frédéric D'Aoust, Dominic Pinel, Vincent J.J. Martin, Jack T. Trevors, Hung Lee
- 单位
- School of Environmental Sciences, University of Guelph; Biology Department, Concordia University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2009）
- DOI
- 10.1002/bit.22449
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
硬木亚硫酸盐废液（HW SSL）中的抑制物（乙酸、糠醛、HMF等）严重抑制戊糖发酵酵母树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的生长和发酵，导致SSL中木糖等戊糖无法被有效利用，而工业上常用酿酒酵母又不能发酵戊糖，因此需要获得对抑制物耐受且能发酵HW SSL中主要糖类产乙醇的菌株。
研究策略
采用紫外（UV）随机诱变，对Pichia stipitis NRRL Y-7124进行三轮连续诱变，每轮诱变后在HW SSL梯度平板上初筛，再在液体稀释SSL中复筛，逐步筛选耐性提升的突变株，并对第三代突变株进行生长与发酵特性表征。
核心内容
本研究通过对戊糖发酵酵母树干毕赤酵母NRRL Y-7124进行三轮紫外随机诱变，结合硬木亚硫酸盐废液梯度平板初筛和液体稀释复筛，逐步筛选出耐受性逐代提高的突变株。获得的第三代突变株PS301和PS302可在80%（v/v）的HW SSL中存活，而野生型仅在稀释至65%时才能生长。在4%葡萄糖加4%木糖的混合糖发酵中，突变株几乎完全利用木糖（约100%），野生型仅利用26.2%；突变株最高乙醇浓度达2.85%（w/v），约为野生型（1.71%）的1.6倍。在60%（v/v）HW SSL中，突变株能完全利用葡萄糖、甘露糖和木糖并发酵产乙醇，最高产量0.64%（w/v），而野生型完全不能发酵任何糖类。突变株对乙酸的耐受阈值也从野生型的0.25%（w/v）提高至0.32%（w/v），但生长产量有所下降。结果表明，随机诱变可快速获得耐受抑制剂且能有效利用混合糖产乙醇的菌株，为工业木质纤维素水解液发酵提供了有潜力的候选菌株。
创新点
['通过三轮UV诱变获得耐受性逐代提高的突变株，其中PS301和PS302可在80%（v/v）HW SSL中存活；', '突变株在葡萄糖-木糖混合糖发酵中显著提高了木糖利用率和乙醇产量，最高乙醇浓度达2.85%（w/v），比野生型提高约1.6倍；', '在60%（v/v）HW SSL中，突变株能完全利用葡萄糖、甘露糖和木糖并发酵产乙醇，而野生型不能发酵任何糖类。']
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia stipitis NRRL Y-7124 | 戊糖（木糖）和己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖）发酵产乙醇通路 | — | — | 催化 | 野生型菌株及其经UV诱变获得的第一至第三代突变株（如PS301、PS302等），主要涉及糖酵解和木糖代谢相关酶系催化的乙醇发酵。 |
关键发现
- ['野生型P. stipitis在HW SSL稀释至65%（v/v）时才能生长，而第三代突变株可在75%（v/v）HW SSL中生长，PS301和PS302甚至能在80%（v/v）HW SSL中存活但细胞数不增加；', '第三代突变株在4%（w/v）木糖上的生长速率为0.23–0.33 h⁻¹，高于野生型的0.20 h⁻¹；在4%（w/v）葡萄糖上的生长速率为0.29–0.37 h⁻¹，高于野生型的0.23 h⁻¹；但生长产量显著低于野生型（木糖：0.63–0.83 g/L vs
- 87 g/L；葡萄糖：1.33–1.8 g/L vs
- 60 g/L）；', '突变株PS301和PS302可在0.32%（w/v）乙酸存在下生长，而野生型仅能耐受0.25%（w/v）；', '在4%（w/v）葡萄糖发酵中，突变株最大乙醇浓度约1.76%（w/v），略高于野生型的1.68%（w/v）；在4%（w/v）木糖发酵中，突变株乙醇产量为1.28%–1.42%（w/v），野生型为1.21%（w/v）；', '在4%（w/v）葡萄糖+4%（w/v）木糖混合发酵中，突变株几乎完全利用木糖（约100%），野生型仅利用26.2%；突变株峰值乙醇浓度为2.43%–2.85%（w/v），其中PS301最高达2.85%（w/v），野生型仅1.71%（w/v）；', '在60%（v/v）HW SSL中，突变株完全利用葡萄糖、甘露糖和木糖并发酵产生乙醇，最大乙醇浓度0.33%–0.64%（w/v），PS301最高为0.64%（w/v），而野生型不发酵任何糖类；', '所有菌株均不能从阿拉伯糖产乙醇，但突变株对阿拉伯糖的消耗（31%–34%）略高于野生型（20%）。']
研究结论
通过三轮UV随机诱变成功获得了对硬木亚硫酸盐废液抑制剂耐受性显著提高的Pichia stipitis突变株，这些突变株不仅能在更高浓度的HW SSL中生长，而且在葡萄糖-木糖混合发酵及60%（v/v）HW SSL中表现出优于野生型的木糖利用和乙醇生产能力。这表明随机诱变是快速获得具有工业应用潜力的抑制剂耐受型戊糖发酵菌株的有效策略。