高级醇 · 代谢工程文献库

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Enhancement of Farnesyl Diphosphate Pool as Direct Precursor of Sesquiterpenes Through Metabolic Engineering of the Mevalonate Pathway in Saccharomyces cerevisiae

作者
Mohammad A. Asadollahi, Jerome Maury, Michel Schalk, Anthony Clark, Jens Nielsen
单位
Department of Systems Biology, Center for Microbial Biotechnology (CMB), Building 223, Technical University of Denmark (DTU), DK-2800 Kgs. Lyngby, Denmark; Faculty of Advanced Sciences and Technologies, Biotechnology Group, University of Isfahan, Isfahan, Iran; Firmenich SA, Corporate R&D Division, Geneva, Switzerland; Firmenich Inc., Corporate R&D Division, Princeton, New Jersey
杂志
Biotechnology and Bioengineering（2010）
DOI
10.1002/bit.22668
所属领域
代谢工程
关键词
Saccharomyces cerevisiaefarnesyl diphosphatemetabolic engineeringmevalonate pathwaysesquiterpenesqualene
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解决的核心问题

通过代谢工程解除酿酒酵母甲羟戊酸途径的调控，增强法尼基焦磷酸（FPP）胞内池，以提高倍半萜（cubebol）的产量，并研究对内源甾醇途径的影响。

研究策略

过表达截短的HMG1（tHMG1）编码的HMG-CoA还原酶催化结构域（基因组整合或质粒表达），并通过替换ERG9天然启动子为MET3启动子下调鲨烯合酶，以增加FPP向目标倍半萜的流向。

研究路线图

100%
研究问题：酿酒酵母FPP池不足，限制倍半萜产量
策略：过表达tHMG1增强FPP供应；下调ERG9减少FPP分流
关键改造1：tHMG1质粒表达或基因组整合过表达
关键改造2：MET3启动子替换下调ERG9鲨烯合酶
结果1：tHMG1过表达使酶活+45%，cubebol产量+40%（质粒表达6.7 mg/L）
结果2：ERG9下调单独使cubebol提高3倍（9.9 mg/L），但无叠加效应
结果3：tHMG1导致角鲨烯积累（9 mg/g DW）及生长速率下降
结论：tHMG1增强FPP有效；ERG9下调独立有效；限速在角鲨烯环氧化酶；总倍半萜52 mg/L可工业化
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核心内容

该研究通过代谢工程改造酿酒酵母的甲羟戊酸途径，旨在解除调控并增强法尼基焦磷酸（FPP）胞内池，以提高倍半萜cubebol的产量。研究者过表达截短的HMG-CoA还原酶（tHMG1），并利用MET3启动子下调鲨烯合酶基因ERG9，从而增加FPP向目标产物的碳流。结果显示，tHMG1过表达使HMG-CoA还原酶比活从4.04±0.49 U/mg升至5.82±0.29 U/mg，cubebol产量由对照的3.2 mg/L提高至6.7 mg/L（质粒表达）或5.1 mg/L（基因组整合）；单独下调ERG9使cubebol产量提升3倍至9.9 mg/L，但与tHMG1过表达组合并无叠加效应。此外，tHMG1过表达导致角鲨烯积累高达9 mg/g DW并降低比生长速率，提示鲨烯环氧化酶是另一限速步骤。最终工程菌株可产约10 mg/L cubebol或52 mg/L总倍半萜（含farnesol）。值得注意的是，cubebol合酶的表达可能通过产物毒性干扰MET3启动子活性，意外恢复了ERG9抑制菌株的麦角固醇合成。该研究为利用酿酒酵母工业化生产倍半萜提供了可行的菌株平台。

创新点

将tHMG1过表达与ERG9下调相结合，系统评估对cubebol产量、角鲨烯和麦角固醇积累的影响；发现cubebol合酶表达可意外恢复ERG9抑制菌株的麦角固醇合成，揭示倍半萜产物对MET3启动子调控的潜在干扰。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae 甲羟戊酸途径（mevalonate pathway） HMG1 (tHMG1) HMG-CoA还原酶催化结构域 催化 过表达增强FPP供应，基因组整合和质粒表达均实施
Saccharomyces cerevisiae 甾醇途径（FPP下游） ERG9 鲨烯合酶（squalene synthase） 催化 通过MET3启动子替换下调表达
Saccharomyces cerevisiae 倍半萜合成途径 GFTPsC cubebol合酶（来自Citrus paradisi） 催化 催化FPP生成cubebol，多产物酶
Saccharomyces cerevisiae 倍半萜合成途径 GFTPsD 瓦伦烯合酶（valencene synthase） 催化 用于评估tHMG1过表达对倍半萜产量的影响

关键发现

  1. tHMG1过表达使HMG-CoA还原酶比活由4.04±0.49 U/mg增至5.82±0.29 U/mg（约增加45%），对应倍半萜产量提高约40%
  2. 质粒过表达tHMG1时cubebol产量达6.7 mg/L（对照3.2 mg/L），基因组整合时为5.1 mg/L
  3. ERG9下调单独使cubebol提高3倍至9.9 mg/L（YIP-MC-07），但结合tHMG1过表达未进一步提高
  4. 最高总倍半萜（含farnesol）约52 mg/L
  5. tHMG1过表达导致角鲨烯积累高达9 mg/g DW，并降低比生长速率。

研究结论

过表达tHMG1能有效增强FPP池并提高倍半萜产量；ERG9下调单独可显著提高cubebol，但与tHMG1过表达无叠加效应。研究还表明角鲨烯环氧化酶是另一限速步骤，且cubebol合酶的表达可能通过产物毒性影响MET3启动子活性，恢复ERG9抑制菌株的甾醇合成。最终获得约10 mg/L cubebol或52 mg/L总倍半萜（含farnesol）的工程菌株，可作为工业开发平台。