Improved Galactose Fermentation of Saccharomyces cerevisiae Through Inverse Metabolic Engineering
- 作者
- Ki-Sung Lee, Min-Eui Hong, Suk-Chae Jung, Suk-Jin Ha, Byung Jo Yu, Hyun Min Koo, Sung Min Park, Jin-Ho Seo, Dae-Hyuk Kweon, Jae Chan Park, Yong-Su Jin
- 单位
- School of Biotechnology and Bioengineering, Sungkyunkwan University; Emerging Technology Research Center, Samsung Advanced Institute of Technology; Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University; Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign; Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2011）
- DOI
- 10.1002/bit.22988
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母虽能发酵半乳糖产乙醇，但半乳糖的乙醇产量和生产率显著低于葡萄糖，需要鉴定有效基因靶点以提高半乳糖发酵效率。
研究策略
采用反向代谢工程策略：构建基因组规模扰动文库（多拷贝质粒pRS424）转化酿酒酵母CEN.PK2-1D，结合平板筛选、连续传代富集和组合筛选三种方法，筛选快速半乳糖发酵转化子；通过质粒测序鉴定过表达靶点，并利用RT-PCR和体外磷酸葡萄糖变位酶（PGM）活性测定验证机制。
核心内容
本研究采用反向代谢工程策略，以酿酒酵母CEN.PK2-1D为底盘，构建基因组规模多拷贝质粒扰动文库，结合平板筛选、连续传代富集与组合筛选，鉴定可提高半乳糖发酵效率的过表达靶点。共获得三个有效靶点，其中SEC53为已知基因，SNR84和截短型TUP1（tTUP1）为新发现靶点。过表达tTUP1使半乳糖消耗速率和乙醇生产率均较对照提高250%，乙醇生产率由0.68 g/L/h升至1.33 g/L/h；过表达SNR84在40 g/L半乳糖发酵中20小时消耗完底物（对照需28小时），体积乙醇生产率提高30%。机制研究表明，tTUP1通过竞争性抑制完整Tup1形成阻遏复合物，部分缓解葡萄糖阻遏并上调GAL1、GAL4、GAL80等基因表达，体外PGM活性测定也证实tTUP1过表达菌株在混合糖条件下酶活显著高于对照。该研究证明改变全局调控网络与过表达限速酶PGM2同样有效，为利用半乳糖丰富的红海藻、乳清及糖蜜等原料生产生物燃料提供了有价值的工业靶点。
创新点
['应用反向代谢工程从基因组文库中鉴定出两个新靶点SNR84和截短型TUP1（tTUP1），显著提高半乳糖发酵性能', '首次揭示截短型Tup1通过竞争性抑制完整Tup1形成阻遏复合物，部分缓解葡萄糖阻遏并上调GAL基因表达的机制', '证明改变全局调控网络（SNR84和tTUP1过表达）与过表达限速代谢酶PGM2同样有效，可显著提高半乳糖发酵效率']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | Leloir pathway（半乳糖利用途径） | SEC53 | 磷酸甘露糖变位酶（phosphomannomutase） | 催化 | 确认的过表达靶点，同时具有磷酸葡萄糖变位酶活性，可催化葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | GAL基因调控网络 | SNR84 | H/ACA box小核仁RNA（snoRNA） | 调控 | 新靶点，参与核糖体RNA伪尿苷化；过表达提高半乳糖消耗速率和乙醇生产率，机制尚不完全清楚 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | GAL基因调控网络（葡萄糖阻遏） | TUP1（截短型tTUP1） | Tup1全局转录共抑制因子 | 调控 | 截短型缺失C端抑制结构域（第280位氨基酸后截断），通过竞争性抑制缓解葡萄糖阻遏，使半乳糖消耗速率和乙醇生产率提高250% |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | Leloir pathway（半乳糖利用途径） | PGM2 | 磷酸葡萄糖变位酶（phosphoglucomutase） | 催化 | 已知过表达靶点，作为对比；过表达使半乳糖摄取率提高70%（引自先前研究） |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | GAL基因调控网络 | GAL1 | 半乳糖激酶（galactokinase） | 催化 | RT-PCR验证显示tTUP1过表达后其mRNA水平显著升高 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | GAL基因调控网络 | GAL4 | Gal4转录激活因子 | 调控 | RT-PCR验证显示tTUP1过表达后其mRNA水平升高 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | GAL基因调控网络 | GAL80 | Gal80转录抑制因子 | 调控 | RT-PCR验证显示tTUP1过表达后其mRNA水平升高 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | GAL基因调控网络（葡萄糖阻遏） | MIG1 | Mig1葡萄糖阻遏因子 | 调控 | RT-PCR显示tTUP1过表达后其mRNA水平也较高，但GAL1和GAL4表达仍因阻遏复合物失活而升高 |
关键发现
- 鉴定出三个过表达靶点：确认靶点SEC53（磷酸甘露糖变位酶）和两个新靶点SNR84（小核仁RNA）及截短型TUP1（tTUP1）。过表达tTUP1使半乳糖消耗速率和乙醇生产率均比对照提高250%，乙醇生产率从0.68 g/L/h提高到1.33 g/L/h
- 在40 g/L半乳糖发酵中，SNR84过表达菌株20 h消耗完半乳糖而对照需28 h，体积乙醇生产率提高30%（0.9 vs 0.6 g/L/h）
- 低细胞密度条件下对照28 h仍残留约40%半乳糖，而SNR84转化子已完全消耗。在葡萄糖+半乳糖混合发酵中，tTUP1转化子8 h消耗完两种糖而亲本菌株需24 h。RT-PCR显示tTUP1过表达使GAL1、GAL4、GAL80 mRNA水平显著升高。体外PGM活性测定显示，tTUP1过表达菌株在葡萄糖/半乳糖/混合糖条件下分别达20.44/31.47/29.70 mU/mg，对照为12.01/14.98/11.00 mU/mg。
研究结论
通过反向代谢工程鉴定出SEC53、SNR84和截短型TUP1三个过表达靶点，其中SNR84和tTUP1通过改变全局调控网络显著提高半乳糖发酵效率，效果与过表达限速酶PGM2相当。tTUP1通过部分缓解葡萄糖阻遏、上调GAL基因表达发挥作用。该研究为利用半乳糖丰富的海洋生物质（如红海藻）、乳清和糖蜜生产生物燃料提供了工业上有价值的靶点。