Farnesol Production From Escherichia coli by Harnessing the Exogenous Mevalonate Pathway
- 作者
- Chonglong Wang, Sang-Hwal Yoon, Asad Ali Shah, Young-Ryun Chung, Jae-Yean Kim, Eui-Sung Choi, Jay D. Keasling, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Sciences (BK21 Program), EB-NCRC and PMBBRC, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Korea; Industrial Biotechnology Research Center, KRIBB, Daejeon, Korea; Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley, California
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2010）
- DOI
- 10.1002/bit.22831
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中实现法尼醇（FOH）的直接高效生产，此前产量极低（389 μg/L）且需体外磷酸酶处理。
研究策略
过表达内源ispA基因增强FPP合成，引入外源完整甲羟戊酸（MVA）途径增加IPP和DMAPP供应，并采用十烷（decane）两相培养减少产物挥发。
核心内容
该研究通过引入外源甲羟戊酸途径并过表达内源ispA基因，在大肠杆菌中实现了法尼醇的直接高效生产。研究构建了携带完整MVA途径和ispA过表达的质粒系统，以甘油为碳源、IPTG诱导培养，并采用十烷两相培养策略减少产物挥发。结果表明，重组菌株以1%甘油为碳源培养48小时，法尼醇产量达135.5 mg/L，较此前报道的389 μg/L提高约350倍；过表达ispA的高拷贝质粒使产量达106.2 mg/L，显著高于低拷贝质粒的65.5 mg/L。对照实验显示，仅依赖内源MEP途径时无法检测到法尼醇，而ispA敲除菌株也不产法尼醇，证实异源MVA途径和IspA的关键作用。此外，敲除aphA、pgpA、pgpB等磷酸酶基因导致产量显著下降，表明FPP向法尼醇的转化由多种杂泛性磷酸酶介导。该研究首次实现在大肠杆菌中直接生产法尼醇，无需体外酶处理，为异戊二烯类化合物的微生物合成提供了有效策略，展示了工业应用潜力。
创新点
首次在大肠杆菌中直接生产法尼醇；利用异源MVA途径显著提高前体供给；原位萃取策略减少了产物损失。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 异戊二烯合成途径（FPP合成） | ispA | FPP合酶（IspA） | 催化 | 过表达以增加FPP供给 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（MVA） | idi | IPP异构酶（IDI） | 催化 | 来自E. coli，存在于质粒pSSN12Didi和pSNA中 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径（MVA） | mvaE | 双功能乙酰CoA硫解酶/HMG-CoA还原酶（MvaE） | 催化 | 来自粪肠球菌（Enterococcus faecalis），MVA途径顶部酶 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径（MVA） | mvaS | HMG-CoA合酶（MvaS） | 催化 | 来自粪肠球菌，MVA途径顶部酶 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径（MVA） | mvaK1 | 甲羟戊酸激酶（MvaK1） | 催化 | 来自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae），MVA途径底部酶 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径（MVA） | mvaK2 | 磷酸甲羟戊酸激酶（MvaK2） | 催化 | 来自肺炎链球菌，MVA途径底部酶 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸途径（MVA） | mvaD | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MvaD） | 催化 | 来自肺炎链球菌，MVA途径底部酶 |
| Escherichia coli BW25113 | FPP去磷酸化 | phoA | 碱性磷酸酶（PhoA） | 催化 | 敲除实验显示对FOH产量影响 |
| Escherichia coli BW25113 | FPP去磷酸化 | aphA | 酸性磷酸酶（AphA） | 催化 | 敲除导致FOH产量显著下降 |
| Escherichia coli BW25113 | FPP去磷酸化 | bacA | 十一异戊烯焦磷酸磷酸酶（BacA） | 催化 | 可能作用于FPP，敲除对产量影响不显著 |
| Escherichia coli BW25113 | FPP去磷酸化 | pgpA | 磷脂酰甘油磷酸磷酸酶（PgpA） | 催化 | 敲除导致FOH产量显著下降 |
| Escherichia coli BW25113 | FPP去磷酸化 | pgpB | 磷脂酰甘油磷酸磷酸酶（PgpB） | 催化 | 敲除导致FOH产量显著下降，双敲除pgpAB无进一步降低 |
关键发现
- 重组大肠杆菌（pSNA、pTispA）以1%甘油为碳源，0.1 mM IPTG诱导培养48小时，FOH产量达135.5 mg/L，较此前报道的389 μg/L提高约350倍；不添加甘油时仅14.1 mg/L，4%甘油时降至42.4 mg/L。过表达ispA（高拷贝pTrc99A）使48小时FOH产量达106.2 mg/L，而低拷贝pBBR1MCS2为65.5 mg/L；与对照（pTrc99A空载）相比，24小时和48小时产量分别提高3倍（56.2 vs
- 0 mg/L）和2倍（106 vs
- 3 mg/L）。仅依赖内源MEP途径（无MVA途径）时检测不到FOH；ispA敲除菌株SF7N不产FOH。敲除aphA、pgpA、pgpB导致FOH产量显著下降。
研究结论
通过引入外源MVA途径并过表达ispA，结合两相培养，成功在大肠杆菌中实现了直接、高产量生产法尼醇，无需体外磷酸酶处理，显示了工业应用潜力。FPP向FOH的转化由多种杂泛性磷酸酶介导，其表达水平不是限速因素。