Functions of Genes and Enzymes Involved in Phenylalilactone Biosynthesis
- 作者
- Martina Daum, Hans-Jörg Schnell, Simone Herrmann, Andreas Günther, Renato Murillo, Rolf Müller, Philippe Bisel, Michael Müller, Andreas Bechthold
- 单位
- Albert-Ludwigs-Universität, Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie; Universidad de Costa Rica, Escuela de Quimica and CIPRONA; Universität des Saarlandes, Institut für Pharmazeutische Biotechnologie; Albert-Ludwigs-Universität, Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Pharmazeutische und Medizinische Chemie
- 杂志
- ChemBioChem（2010）
- DOI
- 10.1002/cbic.201000117
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明苯丙内酯（Phenylalilactone）类抗生素生物合成中相关基因和酶的功能，特别是γ-丁内酯环形成、羟基化、乙酰化等关键修饰步骤的催化机制。
研究策略
通过基因敲除/缺失突变、体外酶活测定、稳定同位素喂养实验结合NMR分析，以及异源表达和点突变等方法，系统研究pla基因簇中各基因的功能。
核心内容
该研究通过基因敲除、异源表达、体外酶活测定及稳定同位素喂养等策略，系统解析了 Streptomyces sp. Tu6071 中苯丙内酯（Phenylalilactone）生物合成途径的关键酶功能。实验表明，plaO2、plaU 和 plaZ 失活后产物谱与野生型一致，确认其不参与已知衍生物合成；plaO3 失活产生新型氧化还原对 PL HS6（m/z 391.2481）与 PL HS7（m/z 389.2324），证明其负责后续氧化步骤；plaO5 失活导致 PL HS2（m/z 730.3776）等新衍生物积累，该化合物为 PL D 的 6′位甲氧基衍生物；plaV 失活则产生 3-脱乙酰基产物 PL X1。体外实验证实 PlaO1 为 FeII/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶，可直接将 PL CD6 转化为 PL HS6，催化 γ-丁内酯环完整形成；PlaO5 作为细胞色素 P450 单加氧酶催化 1-C 羟基化；PlaV 则为 3-O-乙酰转移酶，其 S66 和 K69 点突变导致乙酰化活性丧失。同位素喂养显示 L-[13CH3]蛋氨酸使 C-6′和 C-7′显著富集（37.6 和 39.6），[2-13C]丙酮酸使 C-4、C-8、C-10、C-13 富集，D-[U-13C]葡萄糖喂养证实 C-18 和 C-19 完整来源于葡萄糖。上述结果明确了各修饰步骤的催化顺序与碳原子来源，完善了苯丙内酯的生物合成途径，为后续组合生物合成改造奠定了基础。
创新点
首次确定了PlaO1（FeII/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶）负责γ-丁内酯环的完整形成，PlaO5（细胞色素P450单加氧酶）催化1-C-羟基化；揭示PlaV为3-O-乙酰转移酶，其序列特征类似丝氨酸β-内酰胺酶；通过同位素喂养实验揭示γ-丁内酯碳原子来源于葡萄糖。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯（Phenylalilactone）生物合成途径 | plaO1 | PlaO1 | 催化 | FeII/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶，催化PL CD6生成PL HS6，负责γ-丁内酯环的完整形成 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯（Phenylalilactone）生物合成途径 | plaO5 | PlaO5 | 催化 | 细胞色素P450依赖性单加氧酶，催化PL D和PL D2的1-C-羟基化生成PL A和PL A2 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯（Phenylalilactone）生物合成途径 | plaV | PlaV | 催化 | 推定的乙酰转移酶，序列类似丝氨酸β-内酰胺酶，催化3-O-乙酰化；S66和K69为催化关键残基 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯（Phenylalilactone）生物合成途径 | plaO3 | PlaO3 | 催化 | 氧合酶，plaO3缺失导致积累PL HS6和PL HS7，推测催化PL HS6的下一步氧化 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯（Phenylalilactone）生物合成途径 | plaO2 | PlaO2 | 催化 | 氧合酶，失活后产物谱与野生型相同，不参与已知PL衍生物生物合成 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯（Phenylalilactone）生物合成途径 | plaU | PlaU | 催化 | 脱氢酶，失活后产物谱与野生型相同，不参与已知PL衍生物生物合成 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯（Phenylalilactone）生物合成途径 | plaZ | PlaZ | 催化 | 脱氢酶，失活后产物谱与野生型相同，不参与已知PL衍生物生物合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pLysS | 异源表达 | plaO1 | His6-PlaO1 | 催化 | 用于体外酶活测定，催化PL CD6生成PL HS6 |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pLysS | 异源表达 | plaO5 | His6-PlaO5 | 催化 | 用于体外酶活测定，催化PL D生成PL A |
| Escherichia coli BL21(DE3)/pLysS | 异源表达 | plaV (突变体) | PlaV S66A/K69A | 催化 | 点突变验证S66和K69对乙酰转移酶活性的关键作用 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯生物合成途径-甲基化修饰 | plaP5, plaM1 | PlaP5, PlaM1 | 催化 | 推测的SAM依赖性甲基转移酶，负责吡咯环C-6'和C-7'的甲基化 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯生物合成途径-糖基化 | plaA6 | PlaA6 | 催化 | 糖基转移酶，催化PL MD1糖基化生成PL X1 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | 苯丙内酯生物合成途径-吡咯转移 | plaP2 | PlaP2 | 催化 | 推测参与吡咯部分向C20-OH的转移 |
| Streptomyces sp. Tu6071 | MEP途径（异戊烯基二磷酸合成） | 未指定 | 未指定 | 能量供给 | 同位素喂养证明异戊烯基单元通过MEP途径合成，是萜烯骨架的前体 |
关键发现
- plaO2、plaU和plaZ基因失活后产物谱与野生型一致，表明这些基因不参与已知PL衍生物的生物合成；plaO3失活产生新型化合物PL HS6（m/z
- 2481 [M+H]）和PL HS7（m/z
- 2324 [M+H]），两者为氧化还原对；plaO5失活导致PL HS2（m/z
- 3776 [M+H]）等新衍生物，PL HS2为PL D的6'位甲氧基衍生物；plaV失活产生PL X1（m/z
- 3570 [M+H]）和PL MD1（m/z 528 [M-H]），PL X1为3-脱乙酰基-PL D；体外实验证明PlaO1可将PL CD6转化为PL HS6，PlaO5可将PL D和PL D2分别转化为PL A和PL A2；同位素喂养显示L-[13CH3]蛋氨酸使C-6'和C-7'富集（富集度分别为37.6和39.6），[2-13C]丙酮酸使C-4、C-8、C-10、C-13富集（分别为3.3、2.7、2.4、2.8），D-[U-13C]葡萄糖喂养证实C-18和C-19完整来源于葡萄糖；PlaV的S66和K69点突变导致乙酰化产物丧失或仅产痕迹量。
研究结论
PlaO1催化PL CD6形成γ-丁内酯环的关键步骤，PlaO3为后续氧化所必需，PlaV作为3-O-乙酰转移酶将乙酰基转移到C-3羟基，PlaO5催化最终1-C-羟基化生成PL A；PlaO2、PlaU和PlaZ不直接参与已知PL衍生物的生物合成。该研究完善了苯丙内酯的生物合成途径。