Identification of CYP106A2 as a Regioselective Allylic Bacterial Diterpene Hydroxylase
- 作者
- Sabrina Bleif, Frank Hannemann, Michael Lisurek, Jens Peter von Kries, Josef Zapp, Matthias Dietzen, Iris Antes, Rita Bernhardt
- 杂志
- ChemBioChem（2011）
- DOI
- 10.1002/cbic.201000404
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
细胞色素P450 CYP106A2已知底物局限于3-氧代-Δ4-甾体化合物，需要扩大其底物谱，并探索是否能催化二萜类化合物的选择性羟基化，以及建立实用的全细胞催化体系。
研究策略
采用高通量筛选（基于底物结合引起P450 I型光谱变化）结合理性底物预测（与已知底物结构相似性），体外酶学表征、同源建模与分子对接解析区域选择性，并利用Bacillus megaterium全细胞进行催化生产。
核心内容
该研究首次将细菌细胞色素P450酶CYP106A2鉴定为二萜羟化酶，拓展了其传统上仅限于3-氧代-Δ4-甾体底物的催化谱。作者通过基于底物结合引发P450 I型光谱变化的高通量筛选，从16671个化合物中唯一命中二氢海松酸（解离常数52.93 μM），进而确认松香酸为有效底物。体外酶学表征显示，CYP106A2以2:1的比例区域选择性催化松香酸C12位的烯丙位羟基化，生成12α-与12β-羟基松香酸，其中12α-羟基化最大速率13.5 nmol/min/nmol P450，米氏常数107 μM，12β-羟基化活性约为前者的57%；同源建模与分子对接解释了α取向更有利的空间构象。利用Bacillus megaterium ATCC 13368全细胞体系，在48小时内将0.2 mM松香酸转化为38.2 mg 12β-和25.8 mg 12α-羟基产物，但产物比例翻转（β:α=2:1），且大肠杆菌全细胞无转化活性，说明胞内环境显著影响区域选择性。该工作提供了一种通过全细胞催化一步实现复杂二萜选择性羟基化的实用策略，为细菌P450在萜类结构多样化修饰中的应用开辟了新方向。
创新点
['首次鉴定CYP106A2为细菌来源的P450二萜羟化酶', '发现能对松香酸进行选择性烯丙位12α-和12β-羟基化，一步完成传统有机合成难以实现的反应', '实现Bacillus megaterium全细胞催化制备12α-和12β-羟基松香酸']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium ATCC 13368 | 松香酸羟基化 | cyp106A2 | CYP106A2 | 催化 | 天然宿主，全细胞催化松香酸12α/β烯丙基羟基化 |
| Bacillus megaterium ATCC 13368 (CYP106A2敲除株) | 松香酸羟基化 | — | — | — | 阴性对照，无转化，确证CYP106A2的作用 |
| — | 电子传递 | adR | AdR (adrenodoxin reductase) | 能量供给 | 牛肾上腺皮质来源，NADPH依赖的还原酶，向Adx传递电子 |
| — | 电子传递 | adx | Adx (adrenodoxin) | 能量供给 | 牛肾上腺皮质来源铁硫蛋白，将电子从AdR传递至CYP106A2，实验中使用截短形式Adx4-108 |
| Escherichia coli | 松香酸羟基化 | cyp106A2, adR, adx | CYP106A2, AdR, Adx | 催化 | 全细胞催化尝试，未检测到产物，推测松香酸无法穿过外膜 |
关键发现
- 对16671个化合物进行高通量筛选，发现二氢海松酸为唯一阳性命中，KD=52.93±6.03 μM
- 松香酸被确认为底物，体外生成12α-和12β-羟基松香酸，比例为2:1(α/β)
- 12α-羟基化Vmax=13.5 nmol/min/nmol P450，KM=107 μM，12β-羟基化活性为α的57%，Vmax=8.0 nmol/min/nmol P450，KM=123 μM
- 分子对接表明α-羟基化取向更有利（docking scores：α=-9.604，β=-4.962）
- 全细胞催化中Bacillus megaterium ATCC 13368在48h内将0.2 mM松香酸转化为38.2 mg 12β-和25.8 mg 12α-羟基松香酸，产物比例2:1(β/α)，与体外相反
- E.coli全细胞无转化。
研究结论
CYP106A2能够催化二萜底物松香酸的区域选择性烯丙位12位羟基化，是首个报道的细菌P450二萜羟化酶。利用Bacillus megaterium全细胞体系可实现该羟基化产物的制备，且产物分布与体外不同，提示胞内环境可影响区域选择性。