Cloning, Expression and Purification of Cindoxin, an Unusual Fmn-Containing Cytochrome P450 Redox Partner
- 作者
- David B. Hawkes, Kate E. Slessor, Paul V. Bernhardt, James J. De Voss
- 杂志
- ChemBioChem（2010）
- DOI
- 10.1002/cbic.201000119
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆、表达和纯化来自Citrobacter braakii的P450cin（CYP176A1）的假定氧化还原伴侣cindoxin（Cdx），并表征其生化特性，以及在体外重构P450cin催化体系，尽管其天然还原酶Cdr无法功能性表达。
研究策略
将cinC基因克隆到表达载体pCW中，在E. coli中表达并通过阴离子交换和凝胶过滤两步纯化Cdx；利用质谱和HPLC确认辅因子为FMN；通过氧化还原电位滴定测定不同pH下的氧化还原电位；用E. coli的flavodoxin reductase（Fpr）替代Cdr，与P450cin和Cdx重构活性系统，分析cineole羟化活性及偶联效率。
核心内容
本研究克隆了来自布拉基柠檬酸杆菌的cinC基因，并在大肠杆菌中异源表达了其编码的假定氧化还原伴侣cindoxin（Cdx），通过阴离子交换和凝胶过滤两步纯化获得纯度超过95%的蛋白。质谱和HPLC分析确认Cdx为FMN结合型黄素氧还蛋白，其氧化还原电位滴定显示两个氧化还原态在不同pH下均有催化相关性。由于天然还原酶Cdr无法功能性表达，研究者利用大肠杆菌的黄素氧还蛋白还原酶Fpr替代Cdr，与P450cin和Cdx成功重构了体外催化体系。该体系能以高达1500 min⁻¹的周转数立体选择性羟化cineole生成(1R)-6β-hydroxycineole，NADPH氧化中80%用于底物氧化，表观kcat为32 s⁻¹，Km为3.2 μM。结果表明Cdx与P450cin构成类III型P450氧化还原系统，为理解cineole降解途径及P450催化机制提供了新见解。
创新点
首次报道了cindoxin的克隆表达纯化及全面表征；发现Cdx的氧化还原电位与其它P450相关flavodoxins不同，两个氧化还原态都可能具有催化相关性；成功用Fpr替代Cdr重构了P450cin催化系统，实现了高水平、紧密耦合的立体选择性羟化反应。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Citrobacter braakii | cineole降解途径 | cinC | Cdx | 转运 | FMN-containing flavodoxin，P450cin的氧化还原伴侣，电子传递 |
| Escherichia coli | 异源表达 | cinC | Cdx | 转运 | 在E. coli中重组表达纯化，作为体外重构系统的组分 |
| Escherichia coli | cineole降解（体外重构） | fpr | Fpr | 转运 | E. coli黄素氧还蛋白还原酶，替代Cdr为Cdx提供电子 |
| Citrobacter braakii | cineole降解途径 | cinB | Cdr | 转运 | NADPH依赖性铁氧还蛋白还原酶，未能功能性表达 |
| Citrobacter braakii | cineole降解途径 | — | P450cin（CYP176A1） | 催化 | 催化cineole羟基化为(1R)-6β-hydroxycineole |
关键发现
- Cdx纯度>95%，A456/A280为0.67
- 质谱显示apo蛋白15966 Da，holo蛋白16419 Da，加第二个FMN为16878 Da（假象）
- 摩尔消光系数ε456=10800 M^-1 cm^-1
- pH 6-8时，E1（Q/SQ）在-124~-182 mV，E2（SQ/HQ）约-188~-224 mV
- 用Fpr重构系统，P450cin催化cineole氧化为(1R)-6β-hydroxycineole，周转数最高可达1500 min^-1
- NADPH氧化中80%±2%用于底物氧化，12%±1%生成H2O2，约8%±3%生成水
- 表观kcat=32±1 s^-1，Km=3.2±0.3 μM。
研究结论
Cdx是FMN结合型flavodoxin，与P450cin构成了类III（或IIc）的P450氧化还原系统，能够立体选择性羟化cineole生成(1R)-6β-hydroxycineole，启动C. braakii对cineole的降解代谢。