Migrated Hopene Synthases from Colysis pothifolia and Identification of a Migration Switch Controlling the Number of 1,2-Hydride and Methyl Shifts
- 作者
- Junichi Shinozaki, Masayoshi Hiruta, Takayuki Okada, Kazuo Masuda
- 单位
- Showa Pharmaceutical University
- 杂志
- ChemBioChem（2015）
- DOI
- 10.1002/cbic.201500511
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
克隆和表征来自蕨类植物Colysis的角鲨烯环化酶，阐明控制三萜骨架重排（1,2-氢负和甲基迁移）的分子机制，并鉴定关键氨基酸开关。
研究策略
通过同源克隆和RACE获得SC cDNA，在毕赤酵母中异源表达并分析产物；通过插入突变恢复假基因功能；通过定点突变比较不同SC的活性位点，确定控制迁移次数的关键残基。
核心内容
本研究从蕨类植物Colysis elliptica和C. pothifolia中克隆了五个角鲨烯环化酶cDNA（CEH1、CEH2、CEP、CPH及假基因CPF），并在毕赤酵母中异源表达解析其产物。CEH1和CEH2编码hop-22(29)-ene合酶，CEP编码α-polypodatetraene合酶，CPH编码hop-17(21)-ene合酶，而CPF因22核苷酸缺失丧失活性；通过插入该片段构建突变体CPFa后，其产物转变为fern-9(11)-ene。定点突变揭示了一个关键的“迁移开关”：将CPH的Q276突变为缬氨酸，产物即从hop-17(21)-ene转为fern-9(11)-ene，反向突变CPFa的V281Q则恢复hop-17(21)-ene，活性位点该残基的体积控制了1,2-氢负和甲基迁移的次数。各基因ORF长2064至2109 bp，氨基酸序列同一性为76%至93%。该工作首次在蕨类中鉴定了控制三萜骨架重排次数的分子开关，并发现C. pothifolia基因组中携带CPH基因却呈现不产相应三萜烃的化学表型，为角鲨烯环化酶的催化机制和进化研究提供了新线索。
创新点
首次在蕨类植物中鉴定出控制1,2-氢负和甲基迁移次数的‘迁移开关’（Q276/V281）；首次发现转录假基因CPF可通过22核苷酸插入恢复活性；首次报道蕨类植物中基因型与化学表型不一致的现象。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | CEH1 | hop-22(29)-ene合酶 | 催化 | 产物为hop-22(29)-ene |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | CEH2 | hop-22(29)-ene合酶 | 催化 | 产物为hop-22(29)-ene |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | CEP | α-polypodatetraene合酶 | 催化 | 产物为α-polypodatetraene |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | CPH | hop-17(21)-ene合酶 | 催化 | 产物为hop-17(21)-ene |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | CPFa | fern-9(11)-ene合酶 | 催化 | 由CPF插入23核苷酸恢复活性，产物为fern-9(11)-ene |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | CPH Q276V | 突变型hop-17(21)-ene合酶 | 催化 | 单点突变后产物变为fern-9(11)-ene |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | CPFa V281Q | 突变型fern-9(11)-ene合酶 | 催化 | 产物变为hop-17(21)-ene |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | SHC (I261Q) | squalene-hopene环化酶 | 催化 | 来自Alicyclobacillus acidocaldarius，I261Q突变产生hop-22(29)-ene、hop-17(21)-ene、(17E)-dammara-17,21-diene、(17Z)-dammara-17,21-diene和(18R)-dammara-13(17),21-diene |
| Escherichia coli | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | SHC | squalene-hopene环化酶 | 催化 | 用于cell-free实验，未观察到与α-polypodatetraene反应 |
关键发现
- 从Colysis elliptica和Colysis pothifolia中克隆到5个SC cDNA（CEH1, CEH2, CEP, CPH, CPF），其中CPF为含22核苷酸缺失的转录假基因。CEH1和CEH2编码hop-22(29)-ene合酶，CEP编码α-polypodatetraene合酶，CPH编码hop-17(21)-ene合酶。构建插入突变体CPFa后其产物为fern-9(11)-ene。单点突变CPH Q276V使其产物从hop-17(21)-ene变为fern-9(11)-ene
- CPFa V281Q使其产物从fern-9(11)-ene变为hop-17(21)-ene。细菌SHC I261Q产生多种四环和五环产物（hop-22(29)-ene, hop-17(21)-ene, (17E)-dammara-17,21-diene, (17Z)-dammara-17,21-diene, (18R)-dammara-13(17),21-diene）。ORF长度2064-2109 bp，核苷酸同一性83-95%，氨基酸同一性76-93%。
研究结论
本研究从蕨类中鉴定了三种新SC酶（hop-17(21)-ene合酶、fern-9(11)-ene合酶和α-polypodatetraene合酶），并确定了控制1,2-迁移次数的关键氨基酸开关。CPF假基因的活性恢复证明了序列缺失可导致功能丧失。C. pothifolia中CPH基因的存在与其产onocoroid的化学表型不一致，提示蕨类中SC基因可能广泛分布而无论其是否产生三萜烃。