A cytochrome P450-mediated intramolecular carbon-carbon ring closure in the biosynthesis of multidrug-resistance-reversinglathyrane diterpenoids
- 作者
- Andrew J. King, Geoffrey D. Brown, Alison D. Gilday, Edith Forestier, Tony R. Larson, Ian A. Graham
- 单位
- Centre for Novel Agricultural Products, Department of Biology, University of York; Department of Chemistry, University of Reading
- 杂志
- ChemBioChem（2016）
- DOI
- 10.1002/cbic.201600316
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明麻风树中lathyrane二萜生物合成中由casbene转化为lathyrane所需的分子内碳-碳环闭合机制，并鉴定催化该反应的细胞色素P450酶。
研究策略
基于麻风树基因组中二萜生物合成基因簇的分析，通过qPCR检测基因表达模式，系统发育分析P450家族，在烟草叶片中瞬时共表达候选P450与casbene合成酶，利用LC-MS和NMR鉴定代谢产物，并结合GFP定位验证亚细胞位置，最终提出环闭合机制。
研究路线图
核心内容
该研究以麻风树中具有逆转肿瘤多药耐药活性的lathyrane二萜为对象，旨在阐明其生物合成中由casbene转化为lathyrane环系的关键分子内碳-碳环闭合机制。作者基于麻风树基因组中约300 kb的二萜生物合成基因簇（GenBank NW_012124159），通过qPCR表达分析和系统发育鉴定候选P450，并在本氏烟草叶片中瞬时共表达casbene合成酶与各候选P450，结合LC-MS和NMR鉴定产物。结果发现CYP726A35和CYP726A20催化casbene的5,6-氧化，CYP71D495催化9-氧化，三者协同生成6-羟基-5,9-二酮casbene中间体，随后该中间体经自发烯醇化、双键迁移和分子内羟醛反应形成5/11/3 lathyrane环系，终产物中约80%为jolkinol C、20%为其C8差向异构体。共表达拟南芥DXS和GGPPS可提升二萜产量。该工作首次揭示了P450不仅修饰萜烯骨架，还通过引发分子内环闭合决定lathyrane骨架形成，为异源生产该类抗多药耐药先导化合物提供了酶学基础和策略参考。
创新点
首次报道了lathyrane二萜生物合成中由casbene到lathyrane的分子内碳-碳环闭合机制；发现两个P450（CYP726A35/CYP726A20）催化casbene的5,6-氧化，CYP71D495催化9-氧化，三者协同生成6-羟基-5,9-二酮casbene中间体，该中间体通过自发烯醇化、双键迁移和分子内羟醛反应形成lathyrane环系；揭示了P450不仅修饰萜烯骨架，还负责引发分子内环闭合。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成（GGPP→casbene） | casbene synthase | casbene synthase | 催化 | 来自Jatropha curcas，在烟草中瞬时表达，催化geranylgeranyl pyrophosphate环化生成casbene。 |
| Nicotiana benthamiana | lathyrane生物合成 | CYP726A35 | CYP726A35 | 催化 | 来自Jatropha curcas，定位于质体，催化casbene生成6-羟基-5-酮基casbene（5,6-氧化），可能负责环闭合前氧化。 |
| Nicotiana benthamiana | lathyrane生物合成 | CYP726A20 | CYP726A20 | 催化 | 来自Jatropha curcas，无质体转运肽，定位于细胞质/内质网，同样催化casbene生成6-羟基-5-酮基casbene，但亚细胞定位不同导致产物比例差异。 |
| Nicotiana benthamiana | lathyrane生物合成 | CYP71D495 | CYP71D495 | 催化 | 来自Jatropha curcas，催化casbene生成9-酮基casbene（9-氧化），与CYP726A35共表达时产生lathyrane环化产物。 |
| Nicotiana benthamiana | MEP途径（2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸途径） | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，过表达以提高类异戊二烯前体供应，增加二萜产量。 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜前体合成 | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，过表达以增加geranylgeranyl pyrophosphate供应，促进casbene合成。 |
关键发现
- 从麻风树中鉴定到一个约300 kb的二萜生物合成基因簇（scaffold 123，GenBank NW_012124159）
- CYP726A35和CYP726A20均可催化casbene生成6-羟基-5-酮基casbene（分子量302.23），CYP71D495催化生成9-酮基casbene
- 三者共表达产生jolkinol C及C8差向异构体epi-jolkinol C（约80%为jolkinol C，20%为epi-jolkinol C），以及9-羟基-5-酮基casbene和(3E,6E,11E)-8-羟基-casba-3,6,11-三烯-5,9-二酮
- 共表达拟南芥DXS和GGPPS可提高二萜产量
- 基因序列登录号为KX060558-KX060560。
研究结论
本研究揭示了lathyrane二萜生物合成中关键碳-碳环闭合步骤：casbene经两个P450（5,6-氧化和9-氧化）生成6-羟基-5,9-二酮casbene中间体，随后通过非酶促烯醇化、双键迁移和分子内羟醛反应自发形成5/11/3 lathyrane环系。该发现为利用异源宿主规模化生产lathyrane类抗多药耐药先导化合物提供了基础。