Revealing Additional Stereocomplementary Pairs of Old Yellow Enzymes by Rational Transfer of Engineered Residues
- 作者
- Nathalie Nett, Sabine Duewel, Alexandra Annelis Richter, Sabrina Hoebenreich
- 杂志
- ChemBioChem（2017）
- DOI
- 10.1002/cbic.201600688
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏快速有效的方法获得具有互补立体选择性的 Old Yellow Enzyme (OYE) 变体对，以控制不对称氢化反应的面选择性；现有蛋白质工程策略筛选工作量大，且立体互补的野生型 OYE 极为稀少和底物特异。
研究策略
采用"支架取样"(scaffold sampling)策略：从已有定向进化和理性设计研究中提取热点位置（I、II、III）的工程残基，将其转移到 OYE 家族不同亚组的野生型支架（TsER、NCR、DrER、RmER、XenB 等）中，构建少量突变体，并以三种代表性底物（1、3、5）测试其活性和立体选择性。
研究路线图
核心内容
该研究针对老黄酶（OYE）不对称氢化反应中缺乏立体互补催化对的问题，提出“支架取样”策略：从已有工程研究中提取热点位置I、II、III的工程残基，转移到OYE不同亚组的野生型支架中，仅构建14个异源表达变体，即获得多个高效立体互补的烯还原酶。对底物1，TsER C25D/I67T转化率达95%、TOF为190 h⁻¹，且产生(R)-2的对映体过量最高达98%，为迄今报道的最佳值之一；而野生型TsER和DrER对底物1几乎无活性。对底物3，Asp/Thr变体产(2R,5S)-4（de最高96%），Gly/Thr变体产(2S,5S)-4（de最高92%），首次在第二组成员中实现该立体异构体合成。结果表明，热点I+II的Asp/Thr与Gly/Thr组合是跨支架可靠的立体互补突变对，可同时获得优异活性和选择性，支架取样策略筛选工作量小、成功率高，是蛋白质工程中实用的补充策略，但绝对对映选择性的系统预测仍具挑战。
创新点
1. 首次将"支架取样"策略系统性应用于 OYE 家族；2. 发现热点位点 I+II 的 Asp/Thr 和 Gly/(Thr或wt) 组合是跨支架可转移的可靠立体互补对；3. 获得了多个新的立体互补 OYE 催化对，如 NCR T25D/W66T 是首个能产生 (R)-2 的第一组 OYE 变体；4. 首次报道第二组成员可产生 (2S,5S)-4。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) ΔnemA | C=C 不对称还原 | tsER | TsER | 催化 | 来自 Thermus scotoductus，第二组 OYE。野生型对底物3的 TOF 达667 h⁻¹，转化率100%；突变体 C25D/I67T 对底物1的 TOF 达190 h⁻¹，对底物5转化率98%，产 (S)-6 ee 97%。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) ΔnemA | C=C 不对称还原 | ncr | NCR | 催化 | 来自 Nostoc sp.，第一组 OYE。野生型对底物3转化率84%，TOF 560 h⁻¹；突变体 T25D/W66T 是首个产生 (R)-2 的第一组 OYE 变体，W100I 使底物5转化率达46%，产 (S)-6 ee >99%。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) ΔnemA | C=C 不对称还原 | drER | DrER | 催化 | 第二组 OYE。野生型对底物3的 TOF 达660 h⁻¹，产 (2R,5S)-4；突变体 C40D/I81T 对底物1转化率73%，TOF 146 h⁻¹，对底物3也高效。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) ΔnemA | C=C 不对称还原 | rmER | RmER | 催化 | 第二组 OYE。整体活性较低，野生型对底物3转化率93%，TOF 620 h⁻¹；突变体 C25D/I66T 对底物1转化率7%，稳定性和活性均有下降。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) ΔnemA | C=C 不对称还原 | xenB | XenB | 催化 | 第二组 OYE。野生型对底物3转化率68%，TOF 453 h⁻¹；突变体 T25D/Y66T 无法获得可溶性蛋白，因此未继续研究。 |
关键发现
- 通过支架取样策略，仅构建了14个异源表达变体，即可获得多个高效立体互补的烯还原酶催化剂。对底物1（3-甲基环己-2-烯-1-酮），TsER C25D/I67T 转化率达95%，TOF为190 h⁻¹
- DrER C40D/I81T 转化率73%，TOF 146 h⁻¹
- 而野生型 DrER 和 TsER 对底物1几乎无活性（<1%），但大反应显示它们产生 (S)-2 的 ee 分别为93%和76%，YqjM 野生型产生 (R)-2 的 ee 为78%。突变体 TsER C25G/I67T 可产生 (S)-2，而 C25D/I67T 可产生 (R)-2 且 ee 最高达98%，是迄今报道的最佳值之一。对底物3（(S)-香芹酮），野生型 TsER 和 DrER 的 TOF 分别达667 h⁻¹和660 h⁻¹，转化率接近100%
- 突变体如 TsER C25D/I67T 和 DrER C40D/I81T 也能达到类似高效。立体选择性方面，Asp/Thr 变体产生 (2R,5S)-4（de 最高96%），Gly/Thr 变体产生 (2S,5S)-4（de 最高92%），这是首次在第二组成员中实现 (2S,5S)-4 的合成。对底物5（甲基-2-羟甲基丙烯酸酯），TsER 野生型转化率94%（TOF 39 h⁻¹），C25D/I67T 变体98%（TOF 41 h⁻¹），NCR W100I 变体使原本无活性的反应达到46%转化率
- TsER C25G/I67T 给出79% (R)-6 ee，C25D/I67T 给出97% (S)-6 ee。此外，RmER C25D/I66T 和 DrER C40D/I81T 的熔点相比野生型下降4-10°C。研究还发现，NCR 野生型对底物3 也产 (2R,5S)-4，与所有野生型一致。
研究结论
研究表明，热点位点 I+II 的 Asp/Thr 和 Gly/(Thr或wt) 组合是 OYE 第二组成员中可靠的立体互补突变对，可跨支架转移并获得优异的活性和选择性；而热点位点 III 的 Ile 对第一组的影响更显著。支架取样策略成功率高、筛选工作量小，是蛋白质工程中的实用补充策略，但绝对对映选择性的系统预测仍具挑战。