Characterization the carotenoid productions and profiles of three Rhodosporidium toruloides mutants from Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation

作者: Xinping Lin, Ning Gao, Sasa Liu, Sufang Zhang, Shuang Song, Chaofan Ji, Xiuping Dong, Yichen Su, Zongbao Kent Zhao, Beiwei Zhu
单位: School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, National Engineering Research Center of Seafood; Division of Biotechnology, Dalian Institute of Chemical Physics; Seafood Research and Education Center, Oregon State University
杂志: Yeast（2017）
DOI: 10.1002/yea.3236
所属领域: 代谢工程
关键词: Agrobacterium tumefaciens-mediated transformationCarotenoidsRhodosporidium toruloidesT-DNA insertion mutants
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解决的核心问题

利用农杆菌介导转化（ATMT）改变红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）的类胡萝卜素产量和组成，并鉴定相关突变基因。

研究策略

构建ATMT突变体库，根据颜色差异筛选突变株；用HPLC-MS表征类胡萝卜素谱；用genome walking定位T-DNA插入位点。

研究路线图

100%

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核心内容

本研究利用农杆菌介导转化（ATMT）在红冬孢酵母NP11中构建突变体库，通过颜色差异筛选获得三株类胡萝卜素代谢改变的突变株，并结合HPLC-MS与genome walking进行代谢物谱分析和T-DNA插入位点鉴定。野生型NP11发酵216小时后总类胡萝卜素为940.1 μg/g DCW；白色突变株NP11-5完全丧失类胡萝卜素合成能力；浅橙色突变株NP11-4总产量为野生型的64%，但γ-胡萝卜素含量达到68.2 μg/g DCW，为野生型的1.6倍，占总类胡萝卜素比例提高2.4倍；深红色突变株NP11-8总产量达1136.7 μg/g DCW，为野生型的1.2倍，其中torulene含量提升至148.9 μg/g DCW（9倍），β-胡萝卜素达606.5 μg/g DCW（1.7倍），torularhodin为334.0 μg/g DCW（64%）。T-DNA分别插入RTHO_00032内含子、bZIP转录因子（RTHO_07952）外显子及DUF1479蛋白（RTHO_07650）启动子区域。结果表明ATMT可有效重塑类胡萝卜素组成谱，且插入位点与表型存在关联，为红冬孢酵母的类胡萝卜素途径代谢工程提供了潜在改造靶点。

创新点

首次通过ATMT改变R. toruloides类胡萝卜素组成谱；结合T-DNA标签实现表型-基因型关联。

研究对象（3）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Rhodosporidium toruloides NP11	类胡萝卜素生物合成途径	RTHO_00032	hypothetical protein (RTHO_00032)	调控	T-DNA插入内含子，导致γ-胡萝卜素下游合成受阻，γ-胡萝卜素积累
Rhodosporidium toruloides NP11	类胡萝卜素生物合成途径	RTHO_07952	bZIP转录因子	调控	T-DNA插入外显子，导致bZIP转录因子失活，类胡萝卜素合成受阻，突变株呈白色
Rhodosporidium toruloides NP11	类胡萝卜素生物合成途径	RTHO_07650	DUF1479 domain protein	调控	T-DNA插入启动子，可能下调torulene氧化为torularhodin相关基因表达，导致torulene和β-胡萝卜素积累

关键发现

野生型NP11在216 h发酵后总类胡萝卜素为940.1 μg/g DCW；白色突变株NP11-5不产生类胡萝卜素；浅橙色NP11-4产量为野生型的64%，γ-胡萝卜素含量68.2 μg/g DCW，为野生型1.6倍，占总类胡萝卜素的11%（较野生型提高2.4倍）；深红色NP11-8总类胡萝卜素1136.7 μg/g DCW，为野生型1.2倍，其中torulene为148.9 μg/g DCW（9倍），β-胡萝卜素606.5 μg/g DCW（1.7倍），torularhodin为334.0 μg/g DCW（64%）。生物量：NP11
5 g/L，NP11-4
2 g/L，NP11-5
3 g/L，NP11-8
9 g/L。T-DNA插入位点分别为RTHO_00032内含子、RTHO_07952外显子（bZIP转录因子）、RTHO_07650启动子（DUF1479 domain protein）。

研究结论

ATMT能有效改变R. toruloides的类胡萝卜素产量与组成，获得不同颜色突变株；插入位点可能影响类胡萝卜素合成途径，为后续代谢工程改造提供了靶点。