Co-consumption of sugars or ethanol and glucose in a Saccharomyces cerevisiae strain deleted in the HXK2 gene
- 作者
- Leonie M. Raamsdonk, Jasper A. Diderich, Arthur Kuiper, Monique van Gaalen, Arthur L. Kruckberg, Jan A. Berden, Karel Van Dam
- 单位
- Swammerdam Institute for Life Science (SILS), Faculty of Science, University of Amsterdam; Department of Molecular Cell Physiology, Faculty of Biology, Free University
- 杂志
- Yeast（2001）
- DOI
- 10.1002/yea.746
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母在葡萄糖存在时优先消耗葡萄糖并抑制其他碳源代谢，导致混合碳源无法同时利用。如何通过敲除HXK2解除葡萄糖抑制，实现多种碳源与葡萄糖的共消耗。
研究策略
构建HXK2基因缺失的酿酒酵母菌株（KY116），在好氧批次发酵罐中分别以葡萄糖/蔗糖、葡萄糖/半乳糖、葡萄糖/麦芽糖、葡萄糖/乙醇为混合碳源，通过监测气体交换（CO₂/O₂）、RQ值及胞外代谢物浓度，系统表征其共消耗能力。
核心内容
该研究通过敲除酿酒酵母的HXK2基因，构建了缺失己糖激酶II的KY116菌株，旨在解除葡萄糖抑制效应，实现混合碳源与葡萄糖的同步利用。在好氧批次发酵中，研究者以葡萄糖分别搭配蔗糖、半乳糖、麦芽糖或乙醇作为碳源，通过监测气体交换、呼吸商及胞外代谢物，系统评估了菌株的共消耗能力。结果显示，HXK2缺失菌株在葡萄糖与乙醇混合培养时，最大比耗氧速率达到900 μmol·min⁻¹·(g protein)⁻¹，约为亲本菌株在葡萄糖上的近10倍，并且呼吸商低于1证实了乙醇与葡萄糖可同时消耗。在葡萄糖/蔗糖体系中，该菌株呼吸商接近1，表现为完全氧化生长，而亲本菌株呼吸商高达9。此外，该菌株还能同时利用半乳糖，但麦芽糖混合培养生长较差，最大比生长速率仅0.12 h⁻¹。转录分析显示多个葡萄糖抑制基因显著上调，糖酵解基因下调。这项工作证明敲除HXK2能有效解除葡萄糖抑制，大幅增强氧化代谢能力，使菌株可在过量葡萄糖存在下共消耗多种碳源，为面包酵母改良及异源蛋白生产提供了具有应用潜力的工业宿主。
创新点
首次报道酿酒酵母在葡萄糖充足时能够同时消耗乙醇和葡萄糖；证明HXK2缺失菌株可共消耗蔗糖、半乳糖和乙醇（与葡萄糖同时），并具有极高呼吸速率；结合5-硫代葡萄糖平板实验证明了葡萄糖抑制的解除。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK113-7D, X2180-1A) | 糖酵解/葡萄糖抑制调控网络 | HXK2 | Hexokinase II | 调控 | 己糖激酶II，敲除后解除葡萄糖抑制，参与碳代谢阻遏调控 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蔗糖代谢 | SUC2 | Invertase | 催化 | 编码蔗糖酶，在hxk2缺失菌株中去抑制，负责蔗糖水解 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦芽糖代谢 | MAL32 | Maltase | 催化 | 麦芽糖酶，DNA芯片显示在hxk2缺失菌株中上调2.3倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇代谢 | ADH2 | Alcohol dehydrogenase II | 催化 | 乙醇脱氢酶II，催化乙醇→乙醛，在hxk2缺失菌株中下调1.3倍，需要乙醇诱导 |
| Saccharomyces cerevisiae | 葡萄糖转运 | HXT2/HXT7 | Hxt2p/Hxt7p | 转运 | 高亲和力葡萄糖转运蛋白，在hxk2缺失菌株中去抑制表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦芽糖转运 | MAL基因簇 | Maltose permease | 转运 | 麦芽糖透性酶，主动转运麦芽糖，在hxk2缺失菌株中组成型表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三羧酸循环/氧化磷酸化 | SDH4, ATP3 | Succinate dehydrogenase subunit, F1-γ ATP synthase | 能量供给 | TCA和氧化磷酸化相关基因在hxk2缺失菌株中分别上调2.7倍和2.1倍，增强呼吸能力 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醛酸循环 | ICL1 | Isocitrate lyase | 催化 | 异柠檬酸裂解酶，在hxk2缺失菌株中上调2.2倍，参与乙醇利用 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇同化 | ALD7, ACS1 | Aldehyde dehydrogenase, Acetyl-CoA synthetase | 催化 | 在hxk2缺失菌株中分别上调2.6倍和1.7倍，参与乙醇代谢 |
关键发现
- hxk2缺失菌株在葡萄糖/乙醇混合物中最大比耗氧速率达900 μmol·min⁻¹·(g protein)⁻¹，是其在葡萄糖上氧化生长的4-5倍，是亲本菌株在乙醇上（完全去抑制）的3倍，是亲本在葡萄糖上（呼吸抑制）的近10倍。在葡萄糖/蔗糖混合培养中，hxk2缺失菌株RQ接近1，表明完全氧化生长；而亲本RQ约9。该菌株可同时消耗蔗糖、半乳糖和乙醇（早期指数期RQ<1证实乙醇消耗），但在葡萄糖/麦芽糖混合物中生长差（μmax仅0.12 h⁻¹，其他碳源为0.32 h⁻¹），麦芽糖被水解后细胞内葡萄糖外排，ATP浓度约8 mM，ATP/ADP约5。DNA芯片显示多个葡萄糖抑制基因上调：SDH4
- 7倍、ICL1
- 2倍、ATP3
- 1倍、MAL32
- 3倍；糖酵解基因下调：GPM1
- 1倍、ENO2
- 9倍；乙醇代谢相关ALD7上调2.6倍、ACS1上调1.7倍，ADH2下调1.3倍。
研究结论
敲除HXK2可解除葡萄糖抑制，使酿酒酵母在葡萄糖过量条件下同时利用蔗糖、半乳糖和乙醇，大幅增强氧化代谢能力与呼吸速率。该菌株适合作为面包酵母或异源蛋白生产的工业宿主，能更快耗竭混合碳源并减少废液环境负担。