高级醇 · 代谢工程文献库

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Recombinant yeast as a functional tool for understanding bitterness and cucurbitacin biosynthesis in watermelon (Citrullus spp.)

作者
Rachel Davidovich-Rikanati, Lior Shalev, Nadine Baranes, Ayala Meir, Maxim Itkin, Shahar Cohen, Kobi Zimberl, Vitaly Portnoy, Yutaka Ebizuka, Masaaki Shibuya, Yosef Burger, Nurit Katzir, Arthur A. Schaffer, Efraim Lewinsohn, Ya'akov Tadmor
单位
Institute of Plant Sciences, Newe Ya'ar Research Centre, Agricultural Research Organization; Institute of Plant Sciences, Volcani Centre, Agricultural Research Organization; Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo
杂志
Yeast（2014）
DOI
10.1002/yea.3049
所属领域
代谢工程
关键词
bitternesscucurbitacinscucurbitadienol synthasewatermelon
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解决的核心问题

解析西瓜中苦味与葫芦素生物合成的关系，并鉴定催化葫芦素生物合成第一步的关键酶基因

研究策略

利用酿酒酵母BY4743杂合缺失羊毛甾醇合酶菌株作为异源表达工具，对西瓜中分离的氧化角鲨烯环化酶候选基因进行功能表征，结合LC-TOF-MS分析产物

研究路线图

100%
研究问题：解析西瓜苦味与葫芦素生物合成关系
策略：构建杂合羊毛甾醇合酶酵母异源表达体系
关键改造：克隆候选OSC基因并异源表达
结果1：基因克隆与序列分析（CcCDS1/CcCDS2/CICDS1）
结果2：LC-TOF-MS产物鉴定（葫芦二烯醇vs羊毛甾醇）
结果3：不同西瓜品种果实葫芦素检测对比
结论：CcCDS2是葫芦素合成第一步关键酶，酵母工具有效
意义：阐明苦味丧失机制，助力西瓜育种
酵母BY4743中表达CcCDS1 vs CcCDS2+阳性对照CpCPQ对比
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核心内容

该研究以杂合缺失羊毛甾醇合酶的酿酒酵母BY4743菌株为异源表达工具，解析西瓜苦味与葫芦素生物合成的关系。研究从苦味野生西瓜C. colocynthis中克隆出两个候选氧化角鲨烯环化酶基因CcCDS1和CcCDS2，二者与南瓜CpCPQ序列一致性均为93%，并在酵母中分别异源表达，结合LC-TOF-MS分析产物。结果显示，表达CcCDS2的酵母提取物中出现与葫芦二烯醇标准品一致的峰（保留时间12.8 min，m/z 427.393），而表达CcCDS1的酵母仅产生羊毛甾醇，无葫芦二烯醇。苦味品种果实中检测到葫芦素E和B及其糖苷，非苦味品种未检出。结果表明CcCDS2是西瓜葫芦素生物合成第一步的关键酶，而CcCDS1/CICDS1无此活性，栽培西瓜苦味丧失可能与活性CDS拷贝缺失有关，同时验证了该杂合酵母株是分析植物三萜环化酶功能的有效工具。

创新点

首次利用杂合羊毛甾醇合酶酵母菌株（BY4743）高效鉴定西瓜葫芦素生物合成关键酶；从苦味野生西瓜中克隆并功能验证了CcCDS2具有葫芦二烯醇合酶活性，而与其高度相似的CcCDS1无活性，揭示了苦味丧失可能源于活性CDS拷贝的缺失

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae BY4743_YHR072 萜类/甾醇生物合成（麦角固醇途径） CcCDS2 CcCDS2（葫芦二烯醇合酶） 催化 来自Citrullus colocynthis，异源表达后催化2,3-氧化鲨烯生成葫芦二烯醇
Saccharomyces cerevisiae BY4743_YHR072 萜类/葫芦素生物合成 CcCDS1 CcCDS1（类葫芦二烯醇合酶） 催化 来自Citrullus colocynthis，异源表达未检测到葫芦二烯醇合酶活性
Saccharomyces cerevisiae BY4743_YHR072 萜类/葫芦素生物合成 CICDS1 CICDS1（类葫芦二烯醇合酶） 催化 来自Citrullus lanatus var. lanatus，与CcCDS1几乎相同，未做酵母表达活性检测
Saccharomyces cerevisiae BY4743_YHR072 萜类/葫芦素生物合成 CpCPQ CpCPQ（葫芦二烯醇合酶） 催化 来自南瓜Cucurbita pepo，作为阳性对照，异源表达产生葫芦二烯醇
西瓜（Citrullus spp.） 葫芦素生物合成 CcCDS1, CcCDS2, CICDS1 葫芦二烯醇合酶同源蛋白 催化 从西瓜根系克隆得到，参与葫芦素生物合成第一步

关键发现

  1. 苦味西瓜品种（如C. colocynthis 'Jourdan'、'Hazewa'及C. lanatus var. citroides PI 542114等）果实中均检测到葫芦素E和B及其糖苷，而非苦味品种（C. lanatus var. lanatus 'Big Crimson'等）未检测到葫芦素
  2. 从C. colocynthis中分离到CcCDS1和CcCDS2，两者与南瓜CpCPQ的序列一致性均为93%，CcCDS1与CICDS1核苷酸一致性为99%（仅两个氨基酸差异）
  3. 在酵母中异源表达后，表达CcCDS2的酵母提取物中出现保留时间12.8 min、m/z 427.393（M+H）+和409.382（M+H-H2O）+的峰，与葫芦二烯醇标准品一致，而表达CcCDS1的酵母仅产生羊毛甾醇（13.4 min），无葫芦二烯醇
  4. 阳性对照CpCPQ酵母也积累葫芦二烯醇，空载体对照无葫芦二烯醇

研究结论

苦味西瓜果实中积累葫芦素，非苦味品种不积累；CcCDS2编码有活性的葫芦二烯醇合酶，是西瓜葫芦素生物合成第一步的关键酶，而CcCDS1/CICDS1无此活性，栽培西瓜的苦味丧失可能与活性CDS拷贝的缺失有关；杂合ERG7缺陷酵母株可作为分析植物三萜环化酶功能的有效工具