DNA Transformations of Candida tropicalis with Replicating and Integrative Vectors
- 作者
- Dominique Sanglard, Armin Fiechter
- 单位
- Institute of Biotechnology, ETH-Hönggerberg, CH-8093 Zürich, Switzerland
- 杂志
- Yeast（1992）
- DOI
- 10.1002/yea.320081209
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
为热带假丝酵母(Candida tropicalis)建立高效的DNA转化系统，以支持基因破坏、异源蛋白表达等遗传操作。
研究策略
通过紫外诱变获得稳定的ade2营养缺陷型突变株Ha900，利用带有白色念珠菌ADE2基因和CARS自主复制序列的复制型质粒pMK16进行异源转化；同时克隆热带假丝酵母自身ADE2基因，构建整合型载体pADE2，通过同源重组实现稳定整合。
核心内容
本研究为热带假丝酵母（Candida tropicalis）建立了两种互补的DNA转化系统。首先通过紫外诱变获得ade2营养缺陷型菌株Ha900，其回复突变率低于10⁻⁸。利用携带白色念珠菌ADE2基因及自主复制序列的质粒pMK16实现异源转化，效率为10²至3×10²转化子/微克DNA，质粒以游离多聚体形式复制，转化子呈现粉色和白色两种表型，其中粉色转化子的有丝分裂稳定性仅10±5%，拷贝数高达90~120，而白色转化子稳定性为50±10%，拷贝数为15~20。同时克隆了热带假丝酵母自身的ADE2基因，构建整合型载体pADE2，转化效率为10~20转化子/微克DNA，能通过同源重组在ade2位点实现单拷贝、串联重复及单等位或双等位基因的稳定整合。该研究首次在C. tropicalis中同时建立复制型和整合型转化体系，前者适用于外源基因的瞬时高拷贝表达，后者可实现稳定遗传修饰，为后续该菌株的基因破坏和异源蛋白表达提供了关键工具。
创新点
首次在Candida tropicalis中同时建立了复制型和整合型两种DNA转化系统；克隆了C. tropicalis的ADE2基因；发现pMK16在C. tropicalis中以游离多聚体形式复制，且转化子存在粉色/白色两种不同有丝分裂稳定性的表型。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Candida tropicalis | 腺嘌呤生物合成 | ADE2 | — | 催化 | 克隆自C. tropicalis的ADE2基因，用于构建整合型载体pADE2，互补ade2突变 |
| Candida tropicalis | 腺嘌呤生物合成 | ADE2 | — | 催化 | 来自C. albicans的ADE2基因，携带于pMK16质粒，作为异源互补筛选标记 |
| Candida tropicalis | — | — | — | 调控 | CARS元件（Candida自主复制序列），来自C. albicans，驱动pMK16在C. tropicalis中自主复制 |
| Candida tropicalis | 腺嘌呤生物合成 | ADE1 | — | 催化 | 用于突变株表型鉴定的对照基因，来自C. albicans的质粒#1056 |
关键发现
- pMK16转化Ha900的效率为10^2~3×10^2转化子/μg DNA
- 粉色转化子的有丝分裂稳定性仅为10±5%，而白色转化子为50±10%
- pMK16在白色转化子中的拷贝数估计为15~20，粉色转化子中为90~120
- 从酵母中拯救pMK16到E. coli的频率为10^2~10^3氨苄青霉素抗性菌落/μg基因组DNA
- pADE2转化效率为10~20转化子/μg DNA，并能在ade2位点发生同源整合，出现单拷贝、串联重复及单等位或双等位基因整合等类型
- Ha900的回复突变率低于10^-8。
研究结论
本研究确立了Candida tropicalis的DNA转化系统：复制型载体pMK16可瞬时高拷贝表达外源基因，整合型载体pADE2可实现稳定整合，两种系统互补，为后续基因破坏和异源表达提供了工具。