Increasing sulphite formation in Saccharomyces cerevisiae by overexpression of MET14 and SSUI
- 作者
- Ute E. B. Donalies, Ulf Stahl
- 单位
- Technische Universität Berlin, Institut für Biotechnologie, Fachgebiet Mikrobiologie und Genetik, Gustav-Meyer-Allee 25, D-13355 Berlin, Germany
- 杂志
- Yeast（2002）
- DOI
- 10.1002/yea.849
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过代谢工程提高酿酒酵母中亚硫酸盐的形成，以满足食品和饮料工业对亚硫酸盐的需求，同时避免对细胞代谢的副作用。
研究策略
通过过表达编码硫酸盐同化途径关键酶的基因（MET14、MET16）以及编码亚硫酸盐外排泵的基因（SSU1），并使用HSP26/HSP30启动子实现延时表达；同时分析相关基因转录水平与亚硫酸盐产量的关联。
核心内容
本研究以酿酒酵母为底盘，系统考察了硫酸盐同化还原通路中亚硫酸盐积累的代谢工程策略。通过分别及组合过表达编码APS激酶的MET14、PAPS还原酶的MET16以及亚硫酸盐外排泵SSU1，并利用HSP26/HSP30启动子在发酵后期延时驱动表达，实现了亚硫酸盐产量的显著提升。结果显示，单独过表达MET14可使麦芽汁中亚硫酸盐产量提高7倍（达14 mg/l）；而MET14与SSU1共过表达效果最佳，在麦芽汁中产量达17-19 mg/l，较对照组提高约10倍，且不引入代谢缺陷。相比之下，失活亚硫酸盐还原酶MET10虽也能提高10倍产量，但导致甲硫氨酸营养缺陷。转录分析表明MET14和MET16的mRNA水平与亚硫酸盐形成正相关，限氧条件下添加葡萄糖可进一步提升产量。该研究证明通过强化限速酶和外排泵是提升酿酒酵母亚硫酸盐积累的有效途径，产量可通过启动子和基因拷贝数灵活调控，为工业上无需破坏代谢途径即可高效生产亚硫酸盐提供了可行方案。
创新点
1. 发现MET14转录水平与亚硫酸盐形成正相关；2. 使用HSP26和HSP30启动子在发酵后期延时过表达MET14；3. 将MET14过表达与SSU1外排泵过表达结合，实现亚硫酸盐积累的显著提高（最高10倍），避免了通过基因失活（如MET10）带来的代谢缺陷。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | MET14 | APS kinase | 催化 | APS激酶，催化APS生成PAPS，过表达提高亚硫酸盐形成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | MET16 | PAPS reductase | 催化 | PAPS还原酶，催化PAPS还原为亚硫酸盐，过表达无显著单独效果 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | MET3 | ATP sulphurylase | 催化 | ATP硫酸化酶，催化硫酸盐生成APS，转录水平普遍较低 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | MET10 | Sulphite reductase subunit | 催化 | 亚硫酸盐还原酶α亚基，失活导致亚硫酸盐积累10倍但甲硫氨酸营养缺陷 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | MET5 | Sulphite reductase subunit | 催化 | 亚硫酸盐还原酶β亚基，与MET10共同编码亚硫酸盐还原酶 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | SSU1 | Ssu1p (putative sulphite pump) | 转运 | 推测的亚硫酸盐外排泵，过表达提高亚硫酸盐外排，与MET14共过表达效果显著 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | FZF1 | Fzf1p | 调控 | 转录激活因子，直接调控SSU1表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | SUL1 | High-affinity sulphate transporter 1 | 转运 | 高亲和力硫酸盐转运蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | SUL2 | High-affinity sulphate transporter 2 | 转运 | 高亲和力硫酸盐转运蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫酸盐同化还原通路 | SUL3 | Sul3p | 调控 | 参与SUL2转录调控的因子 |
关键发现
- MET14过表达使亚硫酸盐产量提高7倍（麦芽汁中达14 mg/l）
- MET14和SSU1共过表达使产量提高至10倍（B培养基中6 mg/l，YNB(C)中8 mg/l
- 麦芽汁中17-19 mg/l）
- MET10失活使产量提高10倍但导致甲硫氨酸营养缺陷
- SSU1单独过表达在最小培养基中产量提高2倍（B培养基中1 mg/l，YNB(C)中3 mg/l），但在麦芽汁中无显著效果
- 在限氧条件下添加葡萄糖可进一步提高MET14/SSU1过表达菌株的亚硫酸盐产量
- MET14和MET16的mRNA水平与亚硫酸盐产量正相关。
研究结论
通过过表达MET14（APS激酶）和SSU1（亚硫酸盐外排泵）是提高酿酒酵母亚硫酸盐形成的最有效方式，可在不破坏代谢途径的前提下实现亚硫酸盐积累的显著增加，且产量高低可通过启动子和拷贝数调控。