High efficiency transformation of Schizosaccharomyces pombe pretreated with thiol compounds by electroporation
- 作者
- Minoru Suga, Toyomasa Hatakeyama
- 单位
- Department of Materials and Biosystem Engineering, Toyama University, 3190 Gofuku, Toyama City, Toyama 930-8555, Japan
- 杂志
- Yeast（2001）
- DOI
- 10.1002/yea.753
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种高效、快速且可重复的裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe 电穿孔转化方法，解决现有锂乙酸法步骤繁琐、电穿孔法效率较低的问题。
研究策略
使用硫醇化合物（如二硫苏糖醇 DTT）预处理完整细胞，通过优化 DTT 浓度、渗透压稳定剂、预处理缓冲液成分、细胞生长阶段、细胞浓度、DNA 用量及电脉冲参数，并建立基于非渗透性冷冻保护剂山梨醇的高感受态细胞冷冻保存方案。
核心内容
该研究开发了一种基于硫醇化合物预处理的粟酒裂殖酵母高效电穿孔转化方法。研究者系统优化了二硫苏糖醇（DTT）浓度、渗透压稳定剂、预处理缓冲液成分、细胞生长阶段、细胞浓度、DNA用量及电脉冲参数，并建立了高感受态细胞的冷冻保存方案。在最佳条件（25 mM DTT、0.6 M 山梨醇、20 mM Hepes pH 7.5、30°C处理15分钟、细胞浓度1×10^9 cells/ml、DNA用量10 ng、电场强度11.0 kV/cm）下，最大转化效率达1.2×10^7转化子/μg质粒DNA，较未处理细胞提高约5倍。值得注意的是，预处理缓冲液中存在葡萄糖会使效率急剧下降至1.5×10^5/μg，而ura4菌株经DTT处理后效率也从1.9×10^5提升至2.6×10^6/μg。此外，采用非渗透性冷冻保护剂山梨醇保存的DTT预处理细胞在-80°C下至少6个月内无效率损失。该方法简便快速、重复性好，为裂殖酵母的分子生物学操作提供了高效可靠的技术工具。
创新点
首次系统报道了硫醇化合物预处理对粟酒裂殖酵母电穿孔转化效率的提升作用；发现 DTT 预处理缓冲液中存在葡萄糖会急剧降低转化效率；采用非渗透性冷冻保护剂山梨醇冷冻保存 DTT 预处理的高感受态细胞，在 -80°C 保存 6 个月以上无效率损失。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Schizosaccharomyces pombe (菌株 ATCC38399 h- leu1-32 和 ATCC38436 h- ura4-294) | — | — | — | — | 电穿孔转化宿主，DTT 预处理提高细胞壁通透性 |
关键发现
- DTT 预处理显著提高了转化效率：在 25 mM DTT、0.6 M 山梨醇、20 mM Hepes (pH
- 5)、30°C 处理 15 min，细胞浓度 1×10^9 cells/ml，DNA 用量 10 ng，电场强度
- 0 kV/cm、脉冲时长 5 ms 条件下，最大转化效率达
- 2×10^7 transformants/μg 质粒 DNA，较未处理细胞（1.5×10^6/μg）提高约 5 倍。含葡萄糖的预处理缓冲液使效率从
- 2×10^7 降至
- 5×10^5/μg。菌株 ATCC38436 (ura4-294) 经 DTT 预处理后效率从
- 9×10^5 提高至
- 6×10^6/μg。最佳细胞浓度为 1×10^9 cells/ml，最佳 DNA 量为 10 ng（高于 25 ng 时效率急剧下降）。冷冻保存在 1 M 山梨醇中的 DTT 预处理细胞维持高效率，且至少 6 个月内无损失。
研究结论
建立了粟酒裂殖酵母的高效电穿孔转化方法，通过 DTT 预处理和优化电穿孔条件，最高可获得 1.2×10^7 transformants/μg DNA 的转化效率，且高感受态细胞可在 -80°C 冷冻保存至少 6 个月而不丧失效率，为裂殖酵母的分子生物学操作提供了简便快速的技术。