Malo-ethanolic fermentation in grape must by recombinant strains of Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- H. Volschenk, M. Viljoen-Bloom, R. E. Subden, H. J. J. van Vuuren
- 单位
- Department of Microbiology, University of Stellenbosch; Cool Climate Oncology and Viticulture Institute, Brock University; Department of Food Science, University of Guelph; B.C. Wine Research Centre, University of British Columbia
- 杂志
- Yeast（2001）
- DOI
- 10.1002/yea.743
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母无法高效降解L-苹果酸，而苹果酸-乳酸发酵过程不稳定且不适用于某些芳香型葡萄酒品种，需要构建能进行苹果酸-乙醇发酵的重组酿酒酵母菌株以在酒精发酵期间降酸。
研究策略
将粟酒裂殖酵母的苹果酸通透酶基因(mae1)和苹果酸酶基因(mae2)置于酿酒酵母PGK1启动子和终止子控制下，通过2μm质粒共转化或线性表达盒整合到ILV2/SMR1基因座，构建重组酿酒酵母菌株，实现L-苹果酸向乙醇的转化。
核心内容
本研究将粟酒裂殖酵母的苹果酸通透酶基因mae1和苹果酸酶基因mae2置于酿酒酵母PGK1启动子和终止子控制下，通过2μm质粒共转化或线性表达盒整合到ILV2/SMR1基因座，构建了能够进行苹果酸-乙醇发酵的重组酿酒酵母菌株。携带质粒的重组菌在合成葡萄汁中3天内降解8 g/L L-苹果酸，在霞多丽葡萄汁中11天内降解6.75 g/L；基因组整合单拷贝的重组菌在合成葡萄汁中34小时内降解5 g/L L-苹果酸。对照组无法降解苹果酸，仅含mae2的菌株也不能降解苹果酸，表明mae1编码的通透酶对苹果酸摄取至关重要。重组菌在含苹果酸培养基中持续产生更高水平的乙醇。该策略实现了苹果酸向乙醇的高效转化，为凉爽气候区白葡萄酒（如Sauvignon Blanc、Riesling）的微生物降酸及蒸馏酒生产提供了遗传稳定的重组酿酒酵母菌株。
创新点
['首次在酿酒酵母中引入粟酒裂殖酵母的苹果酸-乙醇发酵途径，实现苹果酸向乙醇的高效转化', '利用PGK1组成型启动子在酿酒酵母中表达粟酒裂殖酵母的mae1和mae2基因', '通过SMR1-410标记将mae1/mae2表达盒整合到ILV2基因座，获得遗传稳定的重组菌株']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YPH259 | 苹果酸-乙醇发酵途径（外源） | mae1 | 苹果酸通透酶 (malate permease) | 转运 | 来自粟酒裂殖酵母，负责L-苹果酸的主动转运（H+同向转运） |
| Saccharomyces cerevisiae YPH259 | 苹果酸-乙醇发酵途径（外源） | mae2 | 苹果酸酶 (malic enzyme) | 催化 | 来自粟酒裂殖酵母，催化L-苹果酸氧化脱羧为丙酮酸和CO2 |
| Saccharomyces cerevisiae YPH259 | 糖酵解/乙醇发酵（宿主内源） | PGK1 | 3-磷酸甘油酸激酶启动子/终止子 | 调控 | 用于驱动mae1和mae2基因在酿酒酵母中的组成型表达 |
| Saccharomyces cerevisiae YPH259 | 支链氨基酸生物合成（整合位点） | ILV2 | 乙酰乳酸合成酶 | 调控 | 整合位点，同时利用SMR1-410基因赋予磺酰脲甲基抗性进行筛选 |
关键发现
- 携带质粒的mae1/mae2重组菌在合成葡萄汁中3天内降解8 g/L L-苹果酸，在霞多丽葡萄汁中11天内降解6.75 g/L
- 基因组整合单拷贝的重组菌在合成葡萄汁中34小时内降解5 g/L L-苹果酸，在Chenin Blanc葡萄汁中10天内降解5 g/L
- 对照组无法降解苹果酸
- 仅含mae2的菌株不能降解苹果酸
- 重组菌在含苹果酸培养基中持续产生更高水平的乙醇。
研究结论
重组酿酒酵母菌株能够高效进行苹果酸-乙醇发酵，降解葡萄汁中的L-苹果酸，且产乙醇水平提高，适用于凉爽气候区白葡萄酒（如Sauvignon Blanc、Riesling、Gewurztraminer）的降酸以及蒸馏酒生产。