Isolation of Carotenoid Hyperproducing Mutants of Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) by Flow Cytometry and Cell Sorting
- 作者
- Byron F. Brehm-Stecher, Eric A. Johnson
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-918-1_14
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
传统诱变筛选类胡萝卜素超产突变体劳动强度大、效率低，难以从大量低产细胞背景中分离出稀有的高产突变体，限制了天然虾青素的高效微生物生产。
研究策略
利用流式细胞术与细胞分选（FCCS）对化学诱变后的红酵母Xanthophyllomyces dendrorhous进行高通量单细胞初级筛选，根据细胞虾青素含量引起的荧光差异（FL4/FL1）富集高产量突变体，再结合传统平板筛选和HPLC验证，实现快速高效分离类胡萝卜素超产突变体。
核心内容
本研究针对传统诱变筛选类胡萝卜素超产突变体效率低下的问题，开发了基于流式细胞术与细胞分选（FCCS）的高通量单细胞筛选方法。研究者对红酵母Xanthophyllomyces dendrorhous进行化学诱变后，利用488 nm激发、FL4通道（675 nm）检测细胞自身荧光差异，通过门控策略富集虾青素含量高的突变体，再结合传统平板筛选和HPLC验证，最终从EMS诱变细胞中分离出虾青素产量较亲本提高1.5至3.8倍的突变体。实验显示，在处理1:100的高产/野生型混合细胞时，C门分选可实现九倍富集，整体筛选效率较传统平板法提高约5倍，共获得39株超产突变体，而平板法仅得7株。以50 μM二苯胺抑制虾青素合成时，高产菌株Y2342的FL4荧光显著降低，证实荧光信号与虾青素含量密切相关。该研究证明FCCS能大幅提升类胡萝卜素超产突变体的分离通量与效率，为加速获取天然虾青素高产菌株提供了高效技术途径。
创新点
将流式细胞术应用于类胡萝卜素超产突变体的初级筛选，显著提高筛选通量和效率；优化了激发波长和检测通道（如488 nm激发，FL4 675 nm荧光监测）；建立门控策略，可对低丰度突变体进行约十倍物理富集；相比传统平板法，整体筛选效率提高5倍左右。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) | 类胡萝卜素生物合成途径（虾青素合成） | — | — | 催化 | 研究对象为红酵母Xanthophyllomyces dendrorhous，通过化学诱变（EMS）后利用流式细胞术筛选虾青素高产的类胡萝卜素超产突变体；文中涉及野生型菌株（如ATCC 24230）、白化突变体（ATCC 96815）及超产突变体（如ATCC 74218等）作为对照。 |
关键发现
- 利用FCCS方法从EMS诱变细胞中筛选到虾青素产量比亲本菌株提高1.5-3.8倍的突变体
- 通过门控策略处理1:100的CHM/野生型混合细胞时，从C门分选可获得九倍的菌株富集
- 该方法的总体效率比传统平板法高5倍，能够分离得到39株类胡萝卜素超产突变体（而传统平板法仅获得7株）
- 以50 μM二苯胺抑制虾青素合成时，高产菌株Y2342在FL4通道的荧光明显降低，验证了荧光与虾青素含量的正相关性。
研究结论
流式细胞术与细胞分选是一种高效的高通量单细胞筛选方法，可显著提高类胡萝卜素超产突变体的分离效率。与化学诱变和传统平板筛选相结合，能加速获得高产量、经济可行的天然虾青素生产菌株。