Engineering Escherichia coli for Canthaxanthin and Astaxanthin Biosynthesis
- 作者
- Qiong Cheng, Luan Tao
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-879-5_7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌本身不合成类胡萝卜素，需异源表达类胡萝卜素合成基因。本研究旨在建立通过组装不同细菌来源的类胡萝卜素基因簇，在大肠杆菌中高效合成角黄素和虾青素的方法，并解决虾青素纯度不足的问题。
研究策略
通过重叠PCR将不同细菌来源的类胡萝卜素合成基因组装成操纵子，克隆至pBHR1载体，在氯霉素抗性基因启动子下表达；引入idi基因增强类胡萝卜素前体供应；通过将crtWZ基因置于启动子近端并优化不同来源的酮酶/羟化酶组合来提高虾青素纯度。
核心内容
本研究通过重叠PCR将不同细菌来源的类胡萝卜素合成基因组装成操纵子，克隆至pBHR1载体并在大肠杆菌中异源表达，以高效合成角黄素和虾青素。研究发现，在操纵子中引入idi基因可显著增强类胡萝卜素前体供应，使总产量提高5倍以上，从200–300 ppm提升至约1400–1800 ppm；进一步通过宿主改造增加异戊二烯通量，产量可高达6000–10000 ppm。针对虾青素纯度不足的问题，系统评估了不同来源的酮酶（crtW）和羟化酶（crtZ）组合及其在操纵子中的排列位置，发现将crtWZ基因置于启动子近端比置于末端更能获得高纯度虾青素。最优质粒pDCQ392（基因排列为crtW263-crtZ263-crtEidiYIB404）的虾青素纯度达到90%，而其他构建体的纯度介于29%至86%之间。该研究建立了一种通过优化基因来源和操纵子内部排列来平衡酮酶与羟化酶表达的策略，为在大肠杆菌中高效合成高纯度虾青素提供了可行方案。
创新点
['组装含idi基因的操纵子使类胡萝卜素产量提高5倍以上', '发现将crtWZ基因放在启动子近端比放在操纵子末端可获得更高的虾青素纯度', '系统评估了不同细菌来源的crtW和crtZ组合对虾青素纯度的影响，获得90%纯度的最优组合']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 异戊二烯途径（非甲羟戊酸途径） | idi | 异戊烯焦磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP之间的异构化，增强类胡萝卜素前体供应，可将产量提高5倍以上 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化FPP转化为GGPP |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 催化两分子GGPP生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 引入共轭双键生成番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtY | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 将番茄红素转化为β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素修饰途径 | crtW | β-紫罗兰酮环酮酶 | 催化 | 催化β-胡萝卜素加氧生成角黄素，不同来源酶活性及底物特异性不同 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素修饰途径 | crtZ | β-紫罗兰酮环羟化酶 | 催化 | 催化β-胡萝卜素环羟化生成玉米黄质，与CrtW协同作用生成虾青素 |
关键发现
['含idi基因的操纵子比不含idi的操纵子类胡萝卜素产量提高5倍以上，产量约为1400-1800 ppm（不含idi为200-300 ppm）', '角黄素合成中，多数crtW基因可实现β-胡萝卜素到角黄素的转化率>90%', '不同质粒构建的虾青素纯度差异大：pDCQ334为75%，pDCQ337为29%，pDCQ339为81%，pDCQ338为85%，pDCQ343为64%，pDCQ378为45%，pDCQ344为86%，pDCQ377为85%，pDCQ381为81%，pDCQ392为90%', '最优虾青素合成质粒pDCQ392的基因排列为crtW263-crtZ263-crtEidiYIB404，虾青素纯度达90%', '通过宿主改造（如增加异戊二烯通量）可将类胡萝卜素产量进一步提高至6000-10000 ppm']
研究结论
建立了通过重叠PCR组装异源类胡萝卜素基因簇并转化大肠杆菌合成角黄素和虾青素的方法。包含idi基因的操纵子能显著提高类胡萝卜素产量；酮酶和羟化酶的平衡表达及在操纵子中的位置对虾青素纯度至关重要；通过选择合适来源的crtW和crtZ并优化操纵子排列，可获得高纯度的虾青素（90%）。