Substrate Specificities of Several Prenyl Chain Elongating Enzymes with Respect to 4-Methyl-4-pentenyl Diphosphate
- 作者
- Masahiko NAGAKI, Yohei MIKI, Minori NAKADA, Jun KAWAKAMI, Haruo KITAHARA, Yuji MAKI, Yoshinori GOTOH, Tokuzo NISHINO, Tanetoshi KOYAMA
- 单位
- Department of Materials Science and Technology, Faculty of Science and Technology, Hirosaki University; Department of Natural Science, Faculty of Education, Hirosaki University; Department of Biological and Material Chemistry, Faculty of Science, Yamagata University; Department of Biochemistry and Engineering, Faculty of Engineering, Tohoku University; Institute of Multidisciplinary Research for Advanced Materials, Tohoku University
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2004）
- DOI
- 10.1271/bbb.68.2070
- 所属领域
- 代谢工程/酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发具有生物活性的同萜硫酸酯类化合物的酶法合成方法，研究多种异戊烯基链延长酶对人工底物4-甲基-4-戊烯基二磷酸（homoIPP）的底物特异性和适用性。
研究策略
利用来自不同生物的异戊烯基链延长酶（FPP合酶、GGPP合酶、HexPP合酶、UPP合酶）催化homoIPP与烯丙基引物（DMAPP、GPP或FPP）缩合，通过磷酸酶处理释放醇产物，并利用HPLC和GC-MS鉴定产物结构与立体化学，计算相对产率。
核心内容
该研究系统考察了来自不同生物的多种异戊烯基链延长酶对人工底物4-甲基-4-戊烯基二磷酸（homoIPP）的底物特异性和立体选择性，旨在为具有生物活性的同萜硫酸酯类化合物开发酶法合成途径。研究者将homoIPP与烯丙基引物（DMAPP、GPP或FPP）进行酶促缩合反应，通过磷酸酶处理释放醇产物，并利用HPLC和GC-MS鉴定产物结构与立体化学，进而比较各酶的相对产率。结果显示，Bacillus stearothermophilus FPP合酶表现出最优催化性能，在DMAPP与homoIPP反应中顺式homo香叶醇产率达45.9%，反式产物为25.5%，且产物构型以顺式为主；Sulfolobus acidocaldarius GGPP合酶也能以较高效率（顺式17.6%、反式28.2%）生成homo法尼醇。相比之下，猪肝FPP合酶虽具顺式专一性但活性极低，M. luteus的HexPP和UPP合酶活性有限，其中UPP合酶仅生成顺式产物。上述结果表明，不同来源的异戊烯基链延长酶对homoIPP的接受度和立体选择性存在显著差异，其中B. stearothermophilus FPP合酶可作为制备抗增殖同萜硫酸酯类化合物的有力工具，为相关活性分子的立体选择性合成提供了新的酶法路线。
创新点
首次系统比较了多种异戊烯基链延长酶对homoIPP的底物特异性；发现Bacillus stearothermophilus FPP合酶能以高效产率生成顺式homo香叶醇（45.9%），为合成抗增殖萜烯硫酸酯提供了新的酶法途径；揭示了不同酶对homoIPP的立体选择性差异（如UPP合酶仅生成顺式产物）。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus stearothermophilus | 异戊二烯/萜类生物合成 | — | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 热稳定FPP合酶，催化homoIPP与DMAPP/GPP缩合，高产顺式产物 |
| Sulfolobus acidocaldarius | 异戊二烯/萜类生物合成 | — | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 重组表达于E. coli DH5α，可接受homoIPP生成顺式和反式产物 |
| Micrococcus luteus B-P 26 | 异戊二烯/萜类生物合成 | — | hexaprenyl diphosphate synthase | 催化 | 由A、B两个异源二聚体组分构成，催化homoIPP与FPP缩合生成顺式和反式产物 |
| Micrococcus luteus B-P 26 | 异戊二烯/萜类生物合成 | — | undecaprenyl diphosphate synthase | 催化 | 仅生成顺式homo香叶基香叶醇，产率2.0% |
| Escherichia coli DH5α | 异戊二烯/萜类生物合成 | — | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 作为重组表达宿主用于表达S. acidocaldarius GGPP合酶 |
关键发现
- B. stearothermophilus FPP合酶催化DMAPP与homoIPP反应，生成顺式-4,8-二甲基壬-3,7-二烯-1-醇（homoGOH）产率45.9%，反式25.5%
- 催化GPP与homoIPP反应，顺式homo法尼醇产率2.9%，反式2.6%。猪肝FPP合酶仅生成顺式产物，但活性极低（约为热稳定酶的1%）。S. acidocaldarius GGPP合酶与GPP反应得顺式homo法尼醇17.6%、反式28.2%
- 与FPP反应得顺式homo香叶基香叶醇6.3%、反式11.2%。M. luteus B-P 26 HexPP合酶与FPP反应得顺式3.5%、反式5.2%
- UPP合酶仅得顺式homo香叶基香叶醇（2.0%）。homoIPP化学合成产率47.0%，homoGGOH化学合成产率16.1%。
研究结论
多种异戊烯基链延长酶能接受homoIPP作为IPP的替代底物，其中B. stearothermophilus FPP合酶以高产率生成顺式homo香叶醇，可用于抗增殖同萜硫酸酯类化合物的立体选择性合成。