Introduction of Bacterial Metabolism into Higher Plants by Polycistronic Transgene Expression
- 作者
- Hideo NAKASHITA, Yuko ARAI, Toshiharu SHIKANAI, Yoshiharu DOI, Isamu YAMAGUCHI
- 单位
- Microbial Toxicology Laboratory, RIKEN Institute; Graduate School of Science and Engineering, Saitama University; Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute of Technology
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2001）
- DOI
- 10.1271/bbb.65.1688
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用多基因转化在高等植物中高效引入细菌来源的代谢途径（如PHB合成），克服传统多基因逐步转化耗时、成本高且易发生基因沉默的问题。
研究策略
利用质体基因组类似原核生物的特点，将细菌操纵子（由aadA、phbC、phbA、phbB组成的多顺反子）通过同源重组整合到烟草质体基因组中，由单个启动子和终止子调控多个基因的共表达。
核心内容
本研究针对传统多基因逐步转化在高等植物中引入细菌代谢途径时操作繁琐、易发生基因沉默的问题，利用质体基因组的结构特点，将细菌来源的PHB合成操纵子（aadA、phbC、phbA、phbB）通过同源重组整合至烟草质体基因组，由单一启动子和终止子驱动多基因的多顺反子共表达，从而整体导入聚羟基丁酸酯（PHB）合成途径。研究获得两个独立转化的烟草品系，通过GC-MS在保留时间6.5分钟处检测到3-羟基丁酸乙酯峰，证实PHB合成途径在质体中功能正常，产量分别为8 ppm和2 ppm干重，与此前胞质表达的约10 ppm水平相当，且植株未见明显形态变化。该结果首次证明细菌操纵子可在高等植物质体中实现多顺反子表达，显著简化多基因代谢工程的操作流程，同时质体母系遗传特性可防止外源基因通过花粉扩散，为以植物为底盘高效生产化学品和药物提供了安全且简捷的新平台，即所谓“植物发酵”体系。
创新点
首次证明细菌操纵子可在高等植物质体中实现多顺反子表达，成功将细菌PHB合成代谢整体导入烟草质体，并提出“植物发酵”概念。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi）质体 | 聚羟基丁酸酯（PHB）生物合成途径 | phbA | β-酮硫解酶 | 催化 | 催化两分子乙酰-CoA缩合生成乙酰乙酰-CoA |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi）质体 | 聚羟基丁酸酯（PHB）生物合成途径 | phbB | 乙酰乙酰-CoA还原酶 | 催化 | 催化乙酰乙酰-CoA还原为3-羟基丁酰-CoA |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi）质体 | 聚羟基丁酸酯（PHB）生物合成途径 | phbC | PHB聚合酶 | 催化 | 催化3-羟基丁酰-CoA聚合生成PHB |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv Xanthi）质体 | 抗生素抗性筛选 | aadA | 氨基糖苷3''-腺苷转移酶 | 催化 | 赋予壮观霉素抗性，作为质体转化的筛选标记 |
关键发现
- 获得两个独立转化的烟草品系（line 1和line 2），GC-MS检测到3-羟基丁酸乙酯峰（保留时间6.5分钟），证明PHB合成途径在质体中功能正常
- PHB产量分别为8 ppm和2 ppm干重，接近之前报道的胞质表达转基因烟草的约10 ppm
- 转基因植物未见明显形态变化。
研究结论
质体多顺反子转化可显著简化多基因代谢工程的操作，避免逐基因添加启动子、终止子和转运肽的繁琐步骤，且质体基因的母系遗传特性可防止外源基因通过花粉扩散，利于环境安全。该体系可用于以植物为底盘生产化学品和药物，称之为“植物发酵”。