Substrate Specificities of Wild and Mutated Farnesyl Diphosphate Synthases from Bacillus Stearothermophilus with Artificial Substrates
- 作者
- Masahiko NAGAKI, Minoru NAKADA, Tohru MUSASHI, Jun KAWAKAMI, Norimasa OHYA, Masayo KURIHARA, Yuji MAKI, Tokuzo NISHINO, Tanetoshi KOYAMA
- 单位
- Department of Frontier Materials Chemistry, Faculty of Science and Technology, Hirosaki University; Department of Biological and Material Chemistry, Faculty of Science, Yamagata University; Department of Biochemistry and Engineering, Faculty of Engineering, Tohoku University; Institute of Multidisciplinary Research for Advanced Materials, Tohoku University
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2007）
- DOI
- 10.1271/bbb.70067
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究野生型和突变型法尼基二磷酸合酶对含羟基和甲氧基的人工底物的底物特异性，理解产物链长控制机制并探索其合成应用。
研究策略
合成8-羟基香叶基二磷酸（HOGPP）和8-甲氧基香叶基二磷酸（CH3OGPP）作为底物，分别用野生型、Y81D和Y81S突变型FPP合酶与IPP反应，通过GC-MS和HPLC鉴定产物结构并测定相对产率，比较不同酶的链长延伸能力。
核心内容
该研究以嗜热脂肪芽孢杆菌法尼基二磷酸合酶为对象，考察野生型及Y81D、Y81S突变体对含羟基或甲氧基人工底物的催化特异性。通过化学合成8-羟基香叶基二磷酸和8-甲氧基香叶基二磷酸，与异戊烯基焦磷酸共反应，利用GC-MS和HPLC鉴定产物结构。结果显示，野生型酶仅催化单次缩合，如催化羟基底物生成12-羟基法尼醇，相对产率11.2%；而将第81位酪氨酸突变为小氨基酸后，酶可进行两次甚至三次缩合，Y81D催化生成16-羟基香叶基香叶醇（38.2%）和20-羟基香叶基法尼醇（1.4%）。甲氧基底物反应活性极高，野生型生成12-甲氧基法尼醇相对产率达188.3%，突变体主要生成16-甲氧基香叶基香叶醇，相对产率204.7%。结果表明Y81是决定链长的关键残基，缩小该位点侧链可放宽底物通道并延长产物链，同时甲氧基修饰底物具有优异反应性，为合成非天然长链异戊二烯化合物提供了酶工程策略。
创新点
发现突变型FPP合酶（Y81S/Y81D）能够利用羟基修饰的底物进行两次甚至三次缩合，生成更长链的产物；而野生型酶只进行单次缩合。甲氧基修饰的底物表现出很高的反应活性，相对产率超过天然底物。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus stearothermophilus | 萜类生物合成途径（异戊二烯代谢） | farnesyl diphosphate synthase基因 | 野生型FPP合酶 | 催化 | 催化IPP与人工烯丙基底物缩合，生成单缩合产物 |
| Escherichia coli DH5α | 异源表达系统 | 突变型farnesyl diphosphate synthase基因（Y81D/Y81S） | 突变型FPP合酶（Y81D/Y81S） | 催化 | Y81突变为天冬氨酸或丝氨酸后，酶可催化双缩合乃至三缩合，产物链长增加 |
| Sus scrofa（猪肝） | 萜类生物合成 | farnesyl diphosphate synthase基因 | 猪肝FPP合酶 | 催化 | 对照实验，催化HOGPP与IPP生成4a-OH，产率29.2% |
关键发现
- 野生型B. stearothermophilus FPP合酶催化HOGPP+IPP生成12-羟基法尼醇（4a-OH），相对产率为11.2%
- 猪肝FPP合酶催化相同反应产率为29.2%。突变型Y81D催化HOGPP+IPP生成4a-OH（0.8%）、16-羟基香叶基香叶醇（5a-OH，38.2%）和20-羟基香叶基法尼醇（6a-OH，1.4%）
- Y81S相应产率分别为1.0%、12.9%和2.6%。野生型FPP合酶催化CH3OGPP+IPP生成12-甲氧基法尼醇（4b-OH），相对产率为188.3%。突变型FPP合酶（Y81D/Y81S）催化CH3OGPP+IPP主要生成16-甲氧基香叶基香叶醇（5b-OH），相对产率204.7%，以及少量4b-OH（Y81D为16.1%，Y81S为痕量）
- 未检测到三缩合产物。
研究结论
野生型FPP合酶对人工底物只催化单次缩合，而将FARM上游第五位酪氨酸（Y81）突变为小氨基酸（丝氨酸或天冬氨酸）后，酶能够催化两次甚至三次缩合，产物链长增加，表明Y81是决定产物链长的关键残基。同时，含甲氧基的人工底物显示出优异的反应活性。