Expression of the Gxf1 transporter from Candida intermedia improves fermentation performance in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- D. Runquist, C. Fonseca, P. Radstrom, I. Spencer-Martins, B. Hahn-Hagerdal
- 单位
- Department of Applied Microbiology, Lund University, P.O. Box 124, 22100 Lund, Sweden; Centro de Recursos Microbiológicos, Department of Life Sciences, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, 2829-516 Caparica, Portugal
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1007/s00253-008-1773-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组木糖利用酿酒酵母在低木糖浓度下，木糖转运成为限速步骤，导致木糖摄取和乙醇生产效率低下。
研究策略
异源表达来自Candida intermedia的葡萄糖/木糖转运蛋白Gxf1，并在有氧/厌氧、批次/恒化培养条件下比较表达菌株与对照菌株的木糖代谢性能。
核心内容
该研究在重组木糖利用酿酒酵母中异源表达了来自Candida intermedia的Gxf1葡萄糖/木糖转运蛋白，以解决低木糖浓度下木糖转运成为限速步骤的问题。通过在有氧/厌氧、批次/恒化培养条件下比较表达菌株TMB 3411与对照菌株TMB 3413的木糖代谢性能，发现表达Gxf1使木糖转运Km从146±8 mM降至88±4 mM，Vmax从22.2±0.8升至30.8±0.7 mmol h⁻¹ (g dw)⁻¹。在4 g/L木糖的有氧批次培养中，表达株150小时OD约5，对照仅约3；但在40 g/L木糖时两株最大比生长速率无显著差异。木糖限制恒化培养中，低稀释率下表达株残留木糖更低，高稀释率下反而更高。厌氧条件下表达株木糖消耗和乙醇生成更快，但最终乙醇浓度相近。结果证实低底物浓度下转运是主要限速步骤，Gxf1可提升低木糖条件下的发酵性能，但高浓度下无改善，且过高表达水平会带来代谢负担。
创新点
['首次在重组木糖利用酿酒酵母中功能性表达Gxf1转运蛋白并系统评估其生理效应', '发现Gxf1仅在低木糖浓度下提高木糖摄取和乙醇生产，而在高浓度下无改善，与代谢控制分析相符']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae TMB 3043及其衍生菌株（TMB 3411等） | 木糖代谢（转运） | GXF1 | Gxf1（葡萄糖/木糖转运蛋白） | 转运 | 来自Candida intermedia，异源表达，由TDH3或TEF1启动子驱动 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢（氧化还原） | XYL1 | 木糖还原酶 | 催化 | 来自Pichia stipitis，由多拷贝质粒pY7表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢（氧化还原） | XYL2 | 木糖醇脱氢酶 | 催化 | 来自Pichia stipitis，由pY7表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木酮糖代谢 | XKS1 | 木酮糖激酶 | 催化 | 内源基因过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷酸戊糖途径（非氧化阶段） | TAL1, TKL1, RKI1, RPE1 | 转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶 | 催化 | 在TMB3043中过表达以提高木糖代谢通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖代谢（副产物） | GRE3 | 醛糖还原酶 | 催化 | 敲除以减少木糖醇生成 |
关键发现
- 表达Gxf1的菌株TMB 3411的木糖转运Km为88±4 mM，对照菌株TMB 3413为146±8 mM（约降低2倍）
- Vmax分别为30.8±0.7和22.2±0.8 mmol h^-1 (g dw)^-1。在4 g/L木糖的有氧批次培养中，表达株150小时OD约5，对照株约3
- 在40 g/L时两株生长速率无显著差异（μmax分别为0.189±0.005和0.197±0.002 h^-1）。在木糖限制恒化培养中，低稀释率(0.03 h^-1)下表达株残留木糖更低，高稀释率(0.12 h^-1)下反而更高。厌氧条件下表达株木糖消耗和乙醇生成更快，但最终乙醇浓度相近，木糖醇产量更高。使用TEF1启动子使GXF1转录水平比TDH3高3倍，但生长更慢，表明表达水平过高有代谢负担。
研究结论
在重组木糖利用酿酒酵母中表达Gxf1转运蛋白可显著提高低木糖浓度下的木糖摄取率、生长速率和乙醇产量，但在高木糖浓度下无改善；提高下游代谢能力后，转运步骤在低底物浓度下成为主要限速因素，Gxf1可在此条件下提升发酵性能。