Efficient synthesis of functional isoprenoids from acetoacetate through metabolic pathway-engineered Escherichia coli
- 作者
- Hisashi Harada, Fengnian Yu, Sho Okamoto, Tomohisa Kuzuyama, Ryutaro Utsumi, Norihiko Misawa
- 单位
- Central Laboratories for Frontier Technology, Kirin Holdings Co., Ltd.; Department of Bioscience, Graduate School of Agriculture, Kinki University; Laboratory of Cell Biotechnology, Biotechnology Research Center, The University of Tokyo
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1007/s00253-008-1724-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用廉价底物乙酰乙酸替代昂贵的甲羟戊酸，在大肠杆菌中高效合成异戊二烯类化合物（倍半萜和类胡萝卜素）
研究策略
在大肠杆菌中表达链霉菌CL190的甲羟戊酸途径基因簇（含II型IPP异构酶），并引入酵母I型IPP异构酶和鼠乙酰乙酸-CoA连接酶（Aacl），使外源乙酰乙酸转化为乙酰乙酰-CoA进入MVA途径，提高IPP/DMAPP供给，从而增强α-蛇麻烯、番茄红素和虾青素等异戊二烯化合物的产量。
核心内容
该研究通过代谢工程改造大肠杆菌JM109，以廉价底物乙酰乙酸替代昂贵的甲羟戊酸，用于高效合成异戊二烯类功能化合物。作者在菌株中表达了链霉菌CL190的甲羟戊酸途径基因簇，同时引入鼠源乙酰乙酸-CoA连接酶（Aacl）将乙酰乙酸转化为乙酰乙酰-CoA，并共表达I型与II型异戊烯焦磷酸异构酶以增强IPP/DMAPP前体供给。在此基础上，分别构建了α-蛇麻烯、番茄红素和虾青素的合成通路。结果显示，α-蛇麻烯产量达958 μg/mL，相比仅表达合酶的对照提高13.6倍；番茄红素产量达12.5 mg/g DCW，提高11.8倍；虾青素体系中总类胡萝卜素含量为5,986 μg/g DCW，是对照的7.5倍。该策略证明乙酰乙酸可作为工业可行的异戊二烯合成底物，为规模化生产倍半萜和类胡萝卜素提供了一种低成本代谢平台。
创新点
首次利用乙酰乙酸（一种结构简单、成本更低的底物）作为异戊二烯合成的主要底物；通过共表达Aacl和两种类型的IPP异构酶显著提高IPP供应；建立了从乙酰乙酸高效合成倍半萜和类胡萝卜素的大肠杆菌平台。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | idi (type 2) from Streptomyces sp. CL190 | 异戊烯焦磷酸异构酶 type 2 | 催化 | 包含于pAC-Mev中的6.5 kb mevalonate基因簇，催化IPP和DMAPP互变 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | Scidi (yeast idi type 1) | 异戊烯焦磷酸异构酶 type 1 | 催化 | 来自酿酒酵母，进一步促进IPP/DMAPP转化 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | Aacl | 乙酰乙酸-CoA连接酶 | 催化 | 来自褐家鼠，将乙酰乙酸直接转化为乙酰乙酰-CoA，进入MVA途径 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | mva gene cluster (HMG-CoA synthase, HMG-CoA reductase, MVA kinase, PMVA kinase, DPMVA decarboxylase) | 甲羟戊酸途径酶系 | 催化 | 来自Streptomyces sp. CL190的6.5kb片段，构成pAC-Mev的核心，催化乙酰乙酰-CoA生成IPP |
| Escherichia coli JM109 | 倍半萜生物合成 | ZSS1 | α-蛇麻烯合酶 | 催化 | 来自香姜（Zingiber zerumbet），将FPP转化为α-humulene |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合酶 (GGPP synthase) | 催化 | 来自Pantoea ananatis，将FPP转化为GGPP |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 (phytoene synthase) | 催化 | 来自P. ananatis，将GGPP转化为八氢番茄红素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 (phytoene desaturase) | 催化 | 来自P. ananatis，将八氢番茄红素转化为番茄红素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 来自P. ananatis，将番茄红素环化为β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自P. ananatis，催化β-胡萝卜素羟化 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | crtW | β-胡萝卜素酮醇酶 (carotenoid 4,4'-ketolase) | 催化 | 来自Brevundimonas sp. SD212，将β-胡萝卜素氧化为虾青素前体 |
关键发现
- α-蛇麻烯产量达958 μg/mL（比仅表达ZSS1的对照提高13.6倍）
- 番茄红素产量达12.5 mg/g DCW（提高11.8倍）
- 虾青素合成体系中总类胡萝卜素含量达5,986 μg/g DCW，为对照的7.5倍（对照797 μg/g DCW），其中番茄红素3,682 μg/g DCW、虾青素及其顺式异构体1,093 μg/g DCW
- 在添加甲羟戊酸内酯时，JM109(pUC-ZSS1+pAC-Mev)的α-蛇麻烯产量可达1,039 μg/mL。
研究结论
通过代谢工程改造大肠杆菌，引入外源甲羟戊酸途径及乙酰乙酸-CoA连接酶，能够以乙酰乙酸为廉价底物高效合成功能异戊二烯，为工业化生产提供了可行策略。